Purification du Lysozyme

PURIFICATION DU LYSOZYME

BUT

Le but de ce TP est de purifier, à l'aide d’une chromatographie échangeuse d’ions, le lysozyme contenu dans le blanc d'œuf, puis de mesurer son activité enzymatique par un dosage enzymatique et enfin de doser les protéines présentes par un dosage colorimétrique de Bradford.

PRINCIPE

La chromatographie échangeuse d'ions :

La chromatographie échangeuse d'ions est une technique de séparation des molécules selon leur charge. La phase stationnaire est une résine échangeuse de cations (chargée négativement) sur laquelle les protéines chargées positivement sont retenues (les protéines chargées négativement ou de charges nulles sont éluées) ou une résine échangeuse d'anions (chargée positivement) sur laquelle les protéines chargées négativement sont retenues (les protéines chargées positivement ou de charges nulles sont éluées). La phase mobile est constituée par les tampons qui passent à travers la colonne. L'élution de molécule d'intérêt se fait selon les pHi croissants. La chromatographie se déroule en trois étapes : la fixation où la molécule d'intérêt se fixe spécifiquement sur la résine, le lavage où on élimine les molécules non spécifiques et l'élution où on récupère la molécule d'intérêt en augmentant le pH du milieu.

Remarque : le choix de la résine est interprété dans la partie Résultats.

La centrifugation :

La centrifugation est une technique permettant de séparer des éléments en suspension dans un liquide, de masse ou de densité différentes sous l'effet de la pesanteur. Il faut un temps suffisant pour que les protéines précipitées (le culot) soient au fond du tube par une accélération suffisamment rapide. On peut récupérer le liquide de protéines solubles (le surnageant) en utilisant la micropipette.

La spectrophotométrie :

Avec un spectrophotomètre, on peut mesurer l'absorbance d'une solution qui absorbe la lumière à une longueur d’onde donnée (dans ce TP 450 nm pour le dosage enzymatique et 595 nm pour le dosage protéique). L'absorbance est proportionnelle à la concentration selon la loi de Beer-Lambert :

A = Ɛ x l x C

ε : coefficient d'extinction molaire (L.mol-1.cm-1)

A : absorbance (pas d’unité)

l : épaisseur de la cuve (cm)

C : concentration (mol.L-1)

Le dosage de l'activité enzymatique :

Le lysozyme est une enzyme qui hydrolyse les liaisons β-1,4 entre l'acide N-acétylmuraminique et les résidus 2-acétamido-2-désoxy-D-glucose des muco-polysaccharides des parois bactériennes. Le substrat qui est une suspension de membranes cellulaires forme un milieu de turbidité. L'activité enzymatique du lysozyme est mise en évidence par la diminution de turbidité du substrat.

Le dosage de Bradford :

Cette méthode est utilisée pour déterminer la concentration de protéines en solution. Le réactif est composé de Brillant Blue Coomassie G250 qui est de couleur brune. En présence des protéines, ce colorant BBC se lie par des liaisons ioniques avec les acides aminés basiques (Arg, His et Lys) et par des interactions hydrophobes avec des acides aminés hydrophobes (Ala, Leu, Ile, etc.). Le complexe colorant-protéine entraîne un changement de couleur du milieu qui passe du brun au bleu (absorbance à 595 nm). Plus il y a de protéines dans la solution, plus la couleur bleue est intense, donc l'absorption à 595 nm augmente. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité de protéine dans les limites de linéarité. Par conséquent, on établit une gamme étalon de tubes contenant le composé à doser à des concentrations connues et croissantes (la solution d'albumine à 0,1 mg/mL). On obtient la droite étalon sous forme A = f(quantité de protéine) pour trouver la concentration protéique inconnue dans les essais à partir de l'absorbance.

RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION

Préparation de la résine :

Dans ce TP, la phase stationnaire est la résine échangeuse de cations CM-cellulose qui est chargée négativement (elle possède un groupement acide carboxylique), c'est-à-dire qu'elle est constituée des billes chargées négativement sur lesquelles les protéines chargées positivement seront retenues tandis que les protéines de charges nulles ou chargées négativement seront éluées. La phase mobile est constituée par le tampon d'équilibration et le tampon d'élution. En effet, le tampon d'équilibration est à un pH de 8,2. Or le pHi de lysozyme est de 11, donc sa charge nette est positive. Les autres protéines dans le blanc d'œuf possèdent les pHi inférieurs à 8,2 (conalbumine 6,8; ovalbumine 4,6 et ovomucoïde 4), par conséquent, elles sont toutes chargées négativement. Alors, seul le lysozyme est retenu par la résine et les autres protéines sont toutes éluées. Pour éluer le lysozyme, il est suffisant d'augmenter le pH à 10,5 (le tampon d'élution) puisque le lysozyme se trouve sous forme zwitterionique.

Préparation des tampons :

Tampon d'équilibration :

Solutions initiales : NaCl = 0,5 M; Tris-HCl = 0,5 M

Solutions finales : NaCl = 0,05 M; Tris-HCl = 0,05 M; V_f=250 mL

C_i×V_i= C_f×V_f

⇔V_i=(C_f×V_f)/C_i =(0,05×250)/0,5=25 mL

On a prélevé 25 mL de NaCl 0,5 M et 25 mL de Tris-HCl 0,5 M et a complété 200 mL d'eau pour avoir un tampon d'équilibration de 250 mL.

Tampon d'élution :

Solutions initiales : 〖〖Na〗_2 〖CO〗_3= 0,2 M; NaHCO〗_3= 0,2 M

Solutions finales : solution tampon carbonate 0,2 M pH 10,5; V_f=40 mL

D'après l'équation de Henderson Hasselbalch,

pH = pKa+log ([Base])/([Acide)

⇔10,5 = 10,3+log ([〖〖CO〗_3〗^(2-)])/([〖〖HCO〗_3〗^-])

⇔log

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