TP Purification du Lysozyme

AMARA Soumeya                                                                         26/02/2020

BLONDEAU-OJEDA Viviane                                                                Groupe C1

TP Purification du Lysozyme

1. But :

Le lysozyme ou mucopolypeptide-N acétyl-muramylhydrolase est une enzyme qui hydrolyse les liaisons bêta-1,4 entre l’acide N-acétylmuraminique et les deux résidus 2-acétamido-2 désoxy D glucose des muco-polysaccharides des parois des bactéries.

Il représente 3% de la totalité des protéines contenues dans le blanc d’œuf. Ce TP a pour but d’extraire et de purifier le lysozyme à partir d’un extrait de blanc d'œuf par chromatographie sur résine échangeuse d’ions. Ensuite, on contrôle la purification par la mesure de l’activité catalytique des différentes fractions de l'enzyme par suivie de la lyse d’une suspension bactérienne à l’aide d’un spectrophotomètre. Pour finir, on utilise la méthode de dosage colorimétrique de Bradford afin de déterminer la teneur en protéines des fractions à l’aide d’une courbe étalon.  

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1. Principes :

• Chromatographie d’échange d’ions

On utilise la méthode de la chromatographie IEX (Ion Exchange Chromatography), ou chromatographie échangeuse d’ions pour purifier le lysozyme. Cette technique permet de séparer les molécules selon leurs charges par variation du pH. Les protéines possèdent des groupements ionisables qui leurs conférant des charges (+), (-) ou nulle suivant le pH. Chaque protéine possède un pH dans lequel leur charge est nulle, le pH isoélectrique = pHi. Les ions des molécules subissent des interactions ioniques avec des charges opposées fixées sur la phase stationnaire, ce qui entraîne leur rétention. La phase stationnaire en question est constituée d'une résine qui contient des groupes fonctionnels chargés. Il existe 2 types de chromatographie échangeuse d’ions : la chromatographie échangeuse d’anions (+) et la chromatographie échangeuse de cations (-).

Pour ce TP nous allons utiliser la chromatographie échangeuse de cations (-). Cette chromatographie est utilisée pour séparer les molécules en fonction de leur charge de surface nette. La chromatographie d'échange de cations, plus spécifiquement, utilise une résine échangeuse d'ions chargée négativement avec une affinité pour les molécules ayant des charges de surface positives nettes. La chromatographie échangeuse de cations est utilisée à la fois à des fins de préparation et d'analyse et peut séparer une large gamme de molécules, allant des acides aminés et des nucléotides aux protéines de grande taille. Il existe aussi différents échangeurs de cations : échangeur fort et échangeur faible. Dans ce TP nous utilisons la résine carboxyméthyl cellulose (CM-cellulose) qui est une résine cationique faible.

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Cette chromatographie est composée de 2 phases :

• Phase stationnaire : est une résine chargée négativement car chromatographie d'échange de cations.

• Phase mobile : solution tampon à pH différents pour éluer la protéine voulue.

La chromatographie se déroule en 3 étapes :

• Phase d’absorption : On introduit une solution constituée de blanc d’œuf et un tampon d'équilibration à pH 8,2. Lorsque le pHpHi les protéines ont une charge nette négative. Le pHi du lysozyme étant de 11, à pH = 8,2, la protéine est chargée positivement alors que les autres protéines ayant des pHi entre 6 et 4 sont chargées négativement donc le lysozyme se fixera sur la résine chargée négativement par interaction ionique.

• Phase de lavage : a pour objectif d’éluer les autres protéines libres. Celle-ci est facilitée par la centrifugation.

• Phase de désorption : a pour but de récupérer le lysozyme fixé sur la résine. Pour cela, on change de pH grâce à l’utilisation d’un tampon de pH 10,5 (Tampon d’élution) de force ionique élevée ce qui va rendre l’enzyme sous sa forme zwitterionique et ainsi provoquer son élution.

• Spectrophotométrie

Le dosage spectrophotométrique est une méthode d’analyse qui permet de déterminer l’absorbance d’une solution c’est-à-dire sa capacité à absorber la lumière qui la traverse. On mesure l’absorbance A d’une solution pour une longueur d’onde donnée (450nm). Le spectrophotomètre est composé d’une source de lumière et d’une fente qui permet d’isoler un faisceau monochromatique. Dans une cuve, on introduit la solution à tester. Un détecteur placé après la cuve permet de détecter les intensités lumineuses avant et après le passage du faisceau.

L’absorbance varie en fonction de la concentration en suivant la loi de Beer-Lambert :

A= ε*C*l

Avec A = absorbance a une longueur d’onde donnée

ε = absorbance appelée aussi coefficient d’extinction spécifique (L.mol-1.cm-1),

l = longueur de la cuve (cm)

C = la concentration en solution (mol/L).

        Cette formule indique une relation de proportionnalité entre l’absorbance et la concentration ce qui implique que la courbe d’étalonnage est une droite. Pour déterminer la concentration d’une solution, cette relation implique la connaissance du coefficient d’extinction molaire de l’espèce à doser. Si ce coefficient est inconnu il sera nécessaire d’établir une gamme d'étalon. Une gamme d'étalon consiste en l'établissement d’une gamme de solutions aux concentrations connues dont on reportera graphiquement l’absorbance en fonction de la concentration. Il suffira de reporter l’absorbance de la solution inconnue pour en déduire sa concentration.

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