Compte Rendu TP: Purification Et Analyse Cinétique De La Trypsine

Biochimie – réactions cellulaires

Compte rendu de travaux pratique : PURIFICATION ET ANALYSE CINETIQUE DE LA TRYPSINE

Introduction

Quelques définitions :

* Une enzyme est un biocatalyseur, agissant à des concentrations très faibles, capable de multiplier la vitesse de réaction par des facteurs très élevés sans en modifier le résultat. Une enzyme donnée est spécifique d’une réaction (elle catalyse toujours la même transformation). Elle est plus efficace qu’un catalyseur chimique.

* La vitesse initiale de réaction est la variation de concentration par unité de temps en déséquilibre totale. Elle s’exprime en M.tps-1. Les mesures de vitesse se réalisent en général en cinétique initiale pour éviter l’inhibition par les produits ou une inactivation de l’enzyme au cours du temps.

* La vitesse maximale Vm est la vitesse initiale que peut atteindre la réaction lorsque l’enzyme est saturée en substrat, c’est à dire lorsque [E]T = [ES]. Ce n’est pas une constante intrinsèque.

* La constante de Michaëlis Km est la concentration en substrat pour laquelle la vitesse enzymatique est égale à la moitié de la vitesse maximale. C’est une constante intrinsèque qui permet de mesurer l’affinité de l’enzyme pour son substrat. La valeur du Km  dépend du pH, de la température et éventuellement du tampon, mais elle n’est pas fonction de la concentration en enzyme.

* La constante catalytique kcat (ou turnover) est le nombre de moles de substrats transformées par moles d’enzyme par unité de temps. Elle s’exprime en tps-1. Elle représente donc le nombre de cycles catalytiques par seconde dont est capable l’enzyme

Pour mieux comprendre le principe de ce TP, il convient tout d’abord d’appréhender le fonctionnement de la trypsine :

La trypsine est une enzyme produite par les acinis du pancréas, qui contribue à la digestion des protéines alimentaires en catalysant l’hydrolyse des liaisons peptidiques de 2acides aminés : la lysine et de l’arginine. Elle agit de ce fait très bien sur un substrat cinétique qui sera ici le BaPNA( Benzoyl L Arginine- Para NitroAniline) selon le mécanisme suivant : Le BaPNA se place sur le site actif de la trypsine et subit une hydrolyse de sa liaison amide (celle juste après son résidu Arginine), ce qui libère un produit de couleur jaune qu’est le Para NitroAniline.

Objectifs

Nous souhaitions purifier de la trypsine bovine pour ensuite analyser ses caractères cinétiques. Pour cela on cherche à déterminer les valeurs de Vm, Km ainsi que de Kcat. Ces différentes valeurs sont reliés par l'équation de Michaelis-Menten : v=Vm×[S]KM+ [S]

Durant ce TP nous apprendrons donc concrètement à utiliser une méthode de purification qu’est la chromatographie échangeuse d’ions, une méthode d’analyse qu’est l’électrophorèse, ou encore l’utilisation du spectrophotomètre en matière d’analyse cinétique enzymatique.

Principes des méthodes utilisées

La chromatographie échangeuse de cations

Le principe est basé sur la séparation de molécules par rapport à leurs charges. Un mélange est déposé sur une colonne constituée de billes chargées négativement, les molécules étant chargées positivement s’y fixeront celles chargées négativement seront éluées. Afin de récupérer les molécules retenues nous utilisons un gradient croissant de concentration en NaCl, en effet les cations Na+ se fixeront à la colonne et libéreront ainsi les molécules chargées positivement.

L'électrophorèse

Le principe est basé sur la séparation des molécules grâce à un champ électrique, dans le cas de l’électrophorèse au SDS-PAGE le gel contient un composant dénaturant : le dodécylsulfate de sodium, il permet de faire migrer les molécules en fonction de leur masse, en effet il permet de masquer la charge nette des molécules en les entourant d’un «nuage négatif» et ainsi de toutes les faire migrer en tant que molécules négatives.

Mesure de l’activité enzymatique des fractions grâce à la spectrophotométrie

Le principe est de mesurer à l’aide du spectrophotomètre l’absorbance d’une solution pour une longueur d’onde donnée. Cette mesure est directement proportionnelle à la concentration du produit étudié. Or la concentration de ce produit est le fruit d’une activité enzymatique plus ou moins intense de la trypsine, c'est-à-dire de la production de la p-nitroaniline.

La concentration en p-nitroaniline peut alors être déduite à partir de la loi de Beer Lambert.

Le pic d’absorbance du produit est à 380nm. Cependant, à cette longueur d’onde le substrat absorbe toujours, alors que nous désirons seulement doser le produit.

A partir de 410nm, le substrat n’absorbe plus tandis que le produit absorbe toujours suffisamment.

C’est pour cela que l’on choisit λ = 410nm.

Dosage des protéines par la méthode de Lowry

Cette méthode est aujourd’hui beaucoup utilisé, et pour cause elle est très utile lors du dosage des protéines, notamment lorsque nous voulons avoir un bilan de purification. Le principe consiste à faire réagir le réactif de FOLIN et un réactif sensible aux liaisons peptidiques (liaisons propre aux protéines) afin de mesurer une absorbance à la longueur d’onde de 710 nm. Grâce à une gamme de référence il est ensuite possible de déterminer la concentration en protéine de nos échantillons.

Détermination des paramètres cinétiques de l’enzyme

En faisant varier la concentration en substrat, il est possible de connaitre le Km et le Vmax de notre enzyme d’intérêt (ici la trypsine) ; en effet après avoir déterminer l’activité enzymatique en

fonction du temps de chacune des concentration en substrat, la détermination de la vitesse enzymatique permet de tracer la courbe de Lineweaver-Burk, cette représentation permet de transformer la courbe [S] en fonction de V, en droite de pente Km/Vm, qui coupe l’axe des ordonnés

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