Compte Rendu Tp Biologie Cellulaire Mitochondries

La mitochondrie est un organite intracellulaire à double membrane présent dans toutes les cellules eucaryotes. Elle intervient dans la production énergétique de la cellule sous forme d'ATP, elle possède son propre génome mitochondrial issu de la mère, et, chaque mitochondrie code pour 13 protéines spécifiques. Elle possède deux membranes séparées par un espace intermembranaire : la membrane externe uniforme et continue qui est le siège du transport passif et la membrane interne formée de crêtes spécialisée dans le transport actif d'ions. Les mitochondries se présentent sous forme d'un réseau qui se fragmente et se fusionne.

Nous pouvons également dire, à propos de celles-ci, qu'elles exercent d'autres fonctions comme les suivantes :

✗ la synthèse des hormones stéroïdes

✗ la synthèse de phospholipides

✗ la synthèse des acides aminés

✗ rôle déterminant dans la mort cellulaire (induit l'apoptose)

Les molécules de pyruvates suivent deux voies métaboliques différentes :

• Fermentation ou dégradation partielle (réaction en anaérobie) :

C6H12O6 + 2 H+ → 2 (C3H5O2) lactate + 2 H+ + 2 ATP

• Respiration cellulaire (réaction en aérobie) :

C6H12O6 + O2 → 6 CO2 + 6 H2O + 36 ATP

Cf. Annexe 1

Lors de la glycolyse, la transformation du glucose en pyruvate induit la production de 2 ATP et de 2 NADH (sachant que 1 NADH équivaut à 3ATP). La glycolyse entraîne la production de 8 ATP.

Pour le cycle de KREBS, 2 ATP sont consommés en entrant dans la mitochondrie. Il y a formation d'1 NADH lors de la transformation du pyruvate en Acétyl-Coa. De plus, 3 NADH , 1 FADH2 et 1 GTP sont libérés lors du cycle de l'acide citrique.

Le bilan énergétique du cycle de KREBS est donc de 12 ATP. On obtient alors 18 ATP grâce à ces deux réactions. Étant donné que deux molécules de pyruvates sont produites, le bilan total de la respiration cellulaire en énergie est de 36 ATP.

But du TP

Le but est de mesurer l'activité enzymatique du succinate cytochrome C réductase. Pour cela, on utilise des mitochondries provenant de parenchymes de pommes de terre.

Méthodes

Dans toute la manipulation, nous travaillons à froid afin d'inhiber l'activité enzymatique et donc on préserve notre échantillon.

➢ Broyage : Au préalable, il faut éplucher les pommes de terre car la peau de celles-ci contiennent des chloroplastes ayant le même poids moléculaire que les mitochondries. Donc, en les enlevant, elles ne seront pas contaminées par ces dernières.

Par la suite, on ajoute aux cubes de pommes de terre (préalablement découpés), un tampon de broyage composé de différents éléments. Le -Tris-HCl (0,1 M) tamponne la solution, grâce à cela le PH ne varie pas, ainsi nous ne dénaturons pas les protéines. Le -Saccharose (0,4 M) qui fait un choc osmotique; c'est-à-dire qu'il y a une concentration en saccharose dans le milieu extra-cellulaire inférieure à celle du cytoplasme, et par entrée d'eau, on observe un gonflement et un éclatement de la cellule. Le -EDTA (1mM) qui est un chorélateur d'ions calcium et magnésium. Les protéases ayant besoin de Ca++ et de Mg++ comme cofacteur, il inhibe ainsi leur fonction. Enfin, le -BSA et cystéines : on donne des protéines à digérer aux protéases, elles saturent ce qui les empêchent de s'attaquer directement aux protéines de la chaîne mitochondriale. Le tout est broyé au mixeur pendant 60 secondes puis est filtré dans un erlen à l'aide d'une double gaze posée dans un entonnoir.

➢ Centrifugations différentielles : Dans cette partie nous réalisons trois centrifugations. Elles séparent les composés en fonction de leur masse moléculaire, leur densité . C'est une sédimentation accélérée. Les composés les plus lourds se retrouvent au fond et les moins lourds en surface.

La première centrifugation s'effectue dans un rotor GSA à 4500 rpm pendant 15 min. Ensuite, on récupère le surnageant 1 afin de n'avoir que les mitochondries, or, dans le culot, on s'attend à trouver des noyaux et des tissus plus lourds que ces mitochondries. La deuxième centrifugation, sur le surnageant 1, s'effectue dans le même rotor à durée équivalente à la première. On

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