TP PURIFICATION DU LYSOZYME

TP PURIFICATION DU LYSOZYME

BUT :

Lors de ce TP nous avons purifié une enzyme « le lysozyme », extrait du blanc d’œuf, grâce à une méthode de séparation, la chromatographie échangeuse d’ions. Nous avons ensuite analysé cette enzyme en mesurant son activité enzymatique par spectrophotométrie ainsi que la quantité de lysozyme présent dans notre échantillon par le dosage de Bradford.

PRINCIPE :

Chromatographie échangeuse d’ions :

        Chromatographie en phase liquide permettant  d’isoler une substance chargée électriquement d’un mélange de molécules chargées.

La séparation dépend de l’adsorption réversible de molécules chargées sur des groupements échangeurs  d’ions de charge opposées.

La phase stationnaire est solide (résine) et contient les groupements échangeurs d’ions alors que la phase mobile est liquide et contient le tampon aqueux avec la molécule à purifier.

Selon le pH de la solution tampon, certaines molécules seront chargées positivement, ou négativement et d’autres seront neutres. Les molécules retenues sont celle qui possède une charge opposée à celle de la résine.  Pour les éluer, il suffit de changer le pH afin de modifier leur charge.

L’enzyme du lysozyme est une petite protéine de 129 résidus, de masse moléculaire faible par rapport aux autres protéines du blanc d’œuf. De plus, elle possède un point isoélectrique élevé (phi =11). Grâce à cette propriété, nous allons pouvoir purifier la protéine  par chromatographie d’échangeuse d’ions. Pour cette chromatographie, nous avons choisi une résine chargée négativement tel le carboxyméthylcellulose (CM-Cellulose). Nous avons utilisé un tampon d’équilibration à pH 8,2 donc à ce pH, la protéine est chargée positivement. Ce qui permet la fixation de l’enzyme sur la résine. Ensuite l’enzyme est éluée en modifiant le pH de la colonne  un tampon d’élution à pH 10,5. A ce pH l’enzyme est sous forme zwitterionique  (chargée nulle). Et donc ne sera plus retenu par la résine chargé négativement.

[pic 1]                                  [pic 2]

Spectrophotométrie :

        La spectrophotométrie est une méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer l'absorbance d'une substance chimique donnée, généralement en solution. Plus l'échantillon est concentré, plus il absorbe la lumière dans les limites de proportionnalité énoncées par la loi de Beer-Lambert A=Ɛ.l.C.

A : absorbance

Ɛ : coefficient d’extinction molaire (mol-1.L.cm-1)

L : longueur de la cuve (cm)

C : concentration de la molécule à doser (mol.L-1)

La densité optique des échantillons est déterminée par un spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur d'onde d'absorption de la substance à étudier. Nous avons donc choisi une longueur d’onde de 450 nm pour mesurer la turbidité de notre solution. En effet, l’enzyme a pour substrat la suspension de membranes de Micrococcus Lysodeikticus à 0,3 mg/ml et lors de l’hydrolyse de cette dernière la turbidité de notre fraction diminue.

Dosage de Bradford :

        La méthode de Bradford est un dosage colorimétrique, basé sur le changement d'absorbance (la mesure se fait à 595 nm), se manifestant par le changement de la couleur du bleu de Coomassie après liaison avec les acides aminés basiques (arginine, histidine, lysine) et les résidus hydrophobes des acides aminés présents dans les protéines.

Cette méthode permet de déterminer la quantité en protéine présent  dans une fraction inconnue à partir d’une gamme étalon et de la droite d’étalonnage qui en découle.        

Résultats

1. Préparation des tampons

• Tampon d’équilibration : 250 ml de Tris-HCl 0,05 M pH 8,2 et NaCl 0,05 M

On part des solutions stock de NaCl de 0.5 M et Tris-HCl 0.5M à ph 8.2.

Pour ce tampon on a : n initial = nfinal . Donc on peut écrire :

[pic 3]

On prélève donc 25 ml de NaCl 0.5M + 25 ml de Tris-HCL 0.5M à pH 8.2 et on ajoute 200 ml d’eau pour avoir notre tampon d’équilibration. On vérifie le pH avec le papier pH.

• Tampon d’élution : 40 ml de solution tampon carbonate 0.2M à pH 10.5[pic 4]

1. Mesure de l’activité enzymatique du Lysozyme

Avant de mesurer l’activité enzymatique des différentes fractions, on détermine les limites où l’activité mesurée est proportionnelle à la quantité d’enzyme ajoutée. Pour cela on va mesurer l’activité enzymatique de différents quantités d’un lysozyme commercial à 150µg / ml

Pour l’échantillon 1 : ΔAcorrigé/min=ΔAlue/min-ΔAblanc/min = 0.045-0.002= 0.043

Pour l’activité enzymatique, on sait qu’une unité correspond à une variation d’absorbance à 450 nm de 0.001.

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