Filtration sur échangeur d’ions (application à la purification du lysozyme d’œuf)

Travaux Pratiques de Génie Biomédical

Filtration sur échangeur d’ions (application à la purification du lysozyme d’œuf)

Introduction

Le lysozyme peut être retrouvé dans diverses sources : sécrétions, tissus végétaux ainsi que blanc d’oeufs. Le lysozyme catalyse l’hydrolyse de liaisons glycosidiques entre des résidus de sucres aminés entrant dans la composition des parois bactériennes. En présence de lysozyme, la paroi des bactéries est lysée. L’objectif de ces travaux pratiques est de purifier le lysozyme de blanc d’oeuf afin d’en déduire le pourcentage de protéines récupérées, le pourcentage d’activité retrouvée et le facteur de purification.

Pour purifier le lysozyme, une chromatographie échangeuse d’ions est réalisée. Dans le cadre de ce TP, l’extrait protéique contenant le lysozyme est introduit dans une colonne échangeuse de cations (la résine est anionique) en présence de tampon Tris-KCl à un pH 8. Ce tampon permet de maintenir la charge des protéines de l’extrait négative, sauf pour le lysozyme qui, à ce pH, est chargé positivement. Les protéines possèdent un point isoélectrique (pHi) plus faible que celui du lysozyme ce qui permet donc leur séparation. Le point isoélectrique (pHi) étant la valeur de pH pour laquelle la molécule étudiée a une charge neutre. Au-delà de cette valeur, la molécule étudiée possède une charge nette négative et en-deçà de cette valeur, la charge nette est positive.  

Les protéines ne sont donc pas retenues par la résine mais le lysozyme l’est. Par la suite, le tampon Tris-HCl est remplacé par le tampon carbonate dont le pH est égal à 10,5. À ce pH, le lysozyme a une charge négative, il n’est donc plus retenu par la résine et est élué.

Résultats:

Une première mesure d’absorbance de chaque tube d’élution a permis de caractériser qualitativement la fraction contenant majoritairement le lysozyme. Cette mesure a été réalisée à 280 nm en raison du maximum d’absorption dans l'ultraviolet des acides aminés aromatiques, Tryptophane, Tyrosine et Phénylalanine, constituants les protéines. Pour cela, la courbe de la densité optique mesurée à 280 nm en fonction des tubes a été réalisée à partir des mesures expérimentales, présentées par le tableau suivant.

Tableau I : Tableau regroupant les mesures expérimentales de densité optique à 280 nm pour chaque tube.

Entre le 12ème et le 13ème tube, le tampon Tris-KCl a été remplacé par du tampon carbonate 0,2 M pH 10,5 (symbolisé par la ligne rouge).

[pic 1]

La fraction F1 contient les protéines de l’extrait brut tandis que la fraction F2 contient le lysozyme.

Une deuxième mesure de densité optique à 280 nm et 260 nm de l’extrait brut et des fractions F1 et F2 pures ou diluées a été réalisée. De plus, la mesure à 260 nm, caractérisant les acides nucléiques, a permis d’éliminer les interférences provoquées par ces derniers par utilisation de la méthode de WARBURG et CHRISTIAN.

A partir des mesures de densité optique à 260 nm et 280 nm, les fractions F1 et F2 ainsi que l’extrait brut ont pu donc être quantifiés.

Tableau II : Tableau regroupant les mesures de densité optique à 280 et 260 nm pour chaque dilution, ainsi que leur quantité de lysozyme.

La concentration en lysozyme de chaque extrait est estimée grâce à la méthode de WARBURG et CHRISTIAN et en tenant compte des facteurs de dilution. Ainsi la concentration de chaque extrait, pur ou dilué, est déterminée. En effet, l’extrait brut dilué au 10ème à une concentration de [lysozyme]=0,472*1,55-0,268*0,76 = 0,52792 mg/mL. Pour calculer la concentration de lysozyme totale de l’extrait, on prend la concentration de lysozyme que l'on multiplie par le facteur de dilution : [lysozyme]totale de l’extrait = 0,52792*10 = 5,0768 mg/mL . Il est nécessaire de prendre en compte le facteur de dilution afin de calculer la concentration totale en lysozyme des fractions.  Il y a donc ((5,2792 + 5,0768)/2)*10 = 5,178 mg de lysozyme par mL d’extrait brut.

...