Introduction TP lysozymes

Le lysozyme est une enzyme (hydrolase/muramidase) impliquée dans la défense contre les infections bactériennes. On retrouve le lysozyme dans de nombreuses sécrétions tel que les larmes ou la salive mais aussi dans le blanc d’œuf de poule. Le nom de « lysozyme » lui est attribué en 1922 par Alexander Fleming avec comme fonction de lyser (couper) les bactéries. En effet, le lysozyme a pour action d’hydrolyser la liaison osidique entre le carbone 1 du 4ème ose (NAM) et le carbone 4 du 5ème ose (NAG), l’acide N-acétyl-muramique (NAM) et le N-acétyl-glucosamine (NAG) du peptidoglycane des bactéries. Il a pour caractéristique d’être une très petite molécule (14,6 kDa) et d’avoir un potentiel hydrogène isoélectrique à 11 qui est nettement supérieur à la majorité des autres protéines du blanc d’œuf.

Pour cette option, nous avons procédé à la purification d’un blanc d’œuf pour pouvoir en isoler les lysozymes présents. Puis nous avons pratiqué une cristallogenèse permettant de voir les cristaux de lysozymes selon différentes concentrations de NaCl et de lysozymes nous permettant de déterminer le diagramme de sursaturation de notre solution protéique. Nous avons aussi procédé à un antibiogramme pour voir les effets de nos fractions sur E. Coli et M. lysodeikticus. Enfin nous avons réalisé une électrophorèse permettant d’estimer la pureté de nos fractions de purification.

I. Purification

Pour étudier ces lysozymes, nous avons donc commencer par faire une purification de ces protéines afin de les isoler.

La Purification se fait en trois parties : la phase d’absorption sélective, la phase de lavages consécutifs et enfin l’élution.

a. Absorption sélective

Le principe de l’absorption sélective est que l’on va récupérer un échantillon de jaune d’œufs où beaucoup de protéines différentes seront présentes, le but est d’isoler les lysozymes grâce à une résine où, eux et seulement eux, vont se fixer

On travaille a pH 10: les lysozymes sont chargés positivement alors que les autres molécules sont chargées négativement ainsi que la résine. Les protéines de lysozyme vont se coller aux anions de la résine à la différence des autres protéines qui vont rester seules (dans F0).

On prélève d’abord donc le jaune d’œuf pour préparer la solution (FO) de base : ajouter du tampon A aux jaunes d’œuf à froid puis remuer doucement. Filtrer les chalazes et en prélever 10 mL. Dans un tube, ajouter 30 mL de tampon A à la solution. On obtient donc notre fraction F0 (V=40 mL).

Prélever ensuite 15 mL de cette fraction F0 et la mettre dans un autre tube avec 10 mL de résine anionique. On obtient ensuite la fraction F1 (V1=25 mL)

Attention, ici seulement 15mL de F0 sont en contact avec la résine donc prendre V0=15mL

Mettre cette fraction F1 au froid pendant 15 min.

Centrifuger pendant 10min la fraction (3000 rpm max)

La centrifugation permet de séparer les complexes de résine-lysozymes des autres protéines. Ces protéines vont former le flow through(en haut dans le tube).

Nous pouvons donc prélever le flow

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