TP : Purification Du Lyzozyme

I/ But

Ce TP a pour but la purification du lysozyme contenu dans le blanc d’œuf par chromatographie échangeuse d’ions.

Nous mesurerons l’activité enzymatique de chaque fraction par spectrophotométrie ainsi que la quantité de protéine de chaque fraction par le dosage de Bradfort. Tout cela nous permettant de déterminer la fraction contenant le plus de lysozyme pur.

II/ Principes

Chromatographie échangeuse d’ion

Lors d’une chromatographie échangeuse d’ions, la séparation dépend de l’adsorption réversible de molécules chargées sur des groupements échangeurs d’ions de charge opposées.

La phase stationnaire est solide (résine) et contient les groupements échangeurs d’ions alors que la phase mobile est liquide et contient le tampon aqueux avec la molécule à purifier.

Selon le pH de la solution tampon, certaine molécules seront chargées positivement, ou négativement et d’autres seront neutres. Les molécules retenues sont celle qui possède une charge opposée à celle de la résine. Pour les éluer, il suffit de changer le pH afin de modifier leur charge.

Dans notre TP, le pH du tampon d’équilibration est de 8,2 donc à ce pH, la protéine est chargée positivement puisque son pHi est de 11.

Afin de retenir la protéine, la colonne doit posséder des charges négatives. On optera donc pour la CM-cellulose qui possède des groupements échangeur d’ions négatifs (carboxyl).

Dosage spectrophotométrique

Il s’agit d’une méthode quantitative qui consiste en la mesure de l’absorbance d’une solution à une longueur d’onde donnée. Cette absorbance est proportionnelle à la concentration de la molécule à doser, d’après la loi de Beer-Lamber A=Ɛ.l.C

A : absorbance

Ɛ : coefficient d’extinction molaire (mol-1.L.cm-1)

L : longueur de la cuve (cm)

C : concentration de la molécule à doser (mol.L-1)

Lors de ce TP, le dosage spectrophotométrique mesure la turbidité à 450 nm. En effet, le lysozyme a pour substrat les membranes et lors de l’hydrolyse de ces dernières, la turbidité de la solution diminue.

La concentration inconnue de la solution sera déterminée grâce à une gamme étalon.

Dosage de Bradford

Cette technique de dosage permet de calculer la quantité de protéine présente dans chaque fraction grâce à l’ajout du réactif de Bradford. Ce dernier est composé de Bleu de Coomassie qui donne une coloration bleu lorsqu’il est fixé de façon non covalente aux protéines (plus précisément sur les groupements aromatique et basiques). La mesure s’effectue à 595 nm.

D’après la loi de Beer-Lambert (A=Ɛ.l.C), l’absorbance est proportionnelle à la quantité de protéine.

Après traçage d’une courbe étalon, on peut calculer la quantité de protéine présente dans chaque fraction.

III/ Résultats

Préparation des tampons

Tampon d’équilibration : 250mL ([Tris-HCl]1 0,05M pH 8,2 ; [NaCl]1 0,05M)

V(NaCl) =" " (〖[NaCl]〗_1 x V_(tot ))/([NaCl]) = (0,05 ×250)/0,5 = 25mL

V(Tris HCl) = (〖[Tris-HCl]〗_1 x V_(tot ))/([Tris-HCl]) = (0,05 ×250)/0,05 = 25mL

+ 200 mL d’eau

Tampon d’élution : (pH = 10,5) 40mL à 0,2M [NaHCO3/Na2CO3] (pKa = 10,3)

pH = pKa + log "[ Na2CO3]" /(["NaHCO3" ])

Or NaHCO3 + Na2CO3 = 100(%) ⇔ NaHCO3 = 100 – Na2CO3

⇔ Na_2 CO_3 〖=10〗^(pH-pKa) × NaHCO_3

⇔ Na_2 CO_3= 〖10〗^(pH-pKa) ×(100-NaHCO_3)

⇔ Na2CO3 = ("100 × " 〖"10" 〗^"pH-pKa" )/("1+" 〖"10" 〗^"pH-pKa" )

⇔ Na2CO3 = ("100 × " 〖"10" 〗^"10,5-10,3" )/("1+" 〖"10" 〗^(10,5-10,3) ) = 61% et NaHCO3 = 39%

Le tampon devant avoir un volume de 40mL et une concentration de 0,2M, il y a alors 8x10-3 moles.

n(Na2CO3) = "61" /"100" x 8x10-3 = 4,88x10-3 mol

Donc V(Na2CO3) = "n(Na2CO3) " /"c(Na2CO3)" = "4,88x10-3 " /"0,2" = 24,4mL

n(NaHCO3) = "39" /"100" x 8x10-3 = 3,12x10-3 mol

Donc V(NaHCO3) = "n(NaHCO3) " /"c(NaHCO3)" = "3,12x10-3 " /"0,2" = 15,6mL

Mesure de l’activité enzymatique du lysozyme

Gamme étalon

Echantillon 0 1 2 3 4 5 6

Membrane (mL)

1,9

NaCl 0,15M (mL)

1,1 1,075 1,05 1,025 1 0,95 0,9

Lysozyme 150 µg/mL (µL) 0 25 50 75 100 150 200

Lysozyme (µg)

0 3,75 7,5 11,25 15 22,5 30

ΔAlue (à 450 nm)

0,0009 0,0136 0,0384 0,0567 0,0664 0,1151 0,1285

ΔAréelle= ΔAlue- ΔAblanc

0 0,0127 0,0375 0,0558 0,0655 0,1142 0,1276

Activité enzymatique réelle (U) 0 12,7 37,5 55,8 65,5 114,2 127,6

Le tube 0 est le blanc de la gamme étalon ainsi que du dosage des fractions.

Activité enzymatique

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