Purification et analyse

CM 7 : Purification et Analyses

Cours 2[pic 1]

I. Dialyse

• Principe :

Procédé de séparation de substances dissoutes, fondé sur leurs différences de diffusibilités à travers des membranes. On peut déterminer un coefficient de diffusion.

• Membranes :

- Cylindres allongés fermés à leurs extrémités                                                                - contiennent les substances à étudier                                                                        - collodion de cellophane, porosité : qqes nm                                                                        - variation possible de la porosité par étirement ou traitement chimique

• Facteurs d'influence : notion de tps de demi-dialysance

- Température                                                                                                           - Surface comparée au volume a analysé                                                                                      - pH

• Méthodes :

- Préparation des membranes (conservation à 4 degrés)                                                                 - Préparation des boudins de dialyse (fermeture, lestage)                                                                        - Chgt de liquide de contre dialyse fréquent                                                                                             - Adaptation des techniques au volume à analyser

• Applications de la dialyse :

- Dessalage, concentration de solutions protéiques, élimination de substances diffusibles.                                                       - Modification d'un pH

Pourquoi faire une dialyse ? Un exemple d'application

Parce que le sel ajouté pour le "salting out" inhibe l'activité des protéines, il doit être enlevé avant de continuité la purif.

La solution protéique est simplement introduite dans un sac formé d'une membrane semi-perméable :

- Perméable aux petites molécules                                                                                                    - Imperméables aux protéines (grosses molécules)  

Ce mvt de sortit des sels de l'échantillon protéique s'accompagne de l'entrée de molécules dans le boudin, donc permet aussi de changer de tampon avant de procédé à l'étape suivante ???????

• Pour résumé :

Dialyse = filtration moléculaire par gradient de concentration.                                                      La séparation : avec une mb semi-perméable laissant passer les petites molécules. (retient les protéines à purifier)

• Limite = molécular weight cut off : Poids moléculaire de coupure : C’est le poids moléculaire du soluté (de la proteine) qui est retenue par la membrane à 90 %.

Composition de la membrane : Cellophane (acétate de cellulose) ou collodion.                                  

Exemple : cf schéma (les sels sont en rouge), on peut renouveler le bain 2 à 3 fois pour éliminer la plus grande partie des sels c'est pour celà que l'on change de tampon.                                                                        Le bain (qui contient le solvant) est le dialysat et le contenu du boudin en fin de dialyse est le rétentat.

[pic 2]

Avec du polyéthylène glycol (=PEG substance déshydratante qui capte l'eau, le boudin de dialyse est placé dans un récipient rectangulaire et on place directement au contact du boudin le polyéthylène glycol sous forme de cristaux, elle va pomper l'eau présente dans le sac de dialyse) à l'extérieur du sac, le dialyse permet de concentrer le contenu du boudin, soit la protéine (le PEG ne rentre pas dans le boudin)

• Application de la dialyse :

En biochimie:

- Dessaler un solution protéique (cf plus haut)                                                                                             - Débarrasser une solution à analyser de ses protéines                                                                  - Concentrer des solutions protéiques                                                                                 - étudier la liaison d'une enz à son S

Concentration du soluté dans le rétentat : cette concentration du soluté diminue dans le rétentat au cours du tps suivant une loi exponentielle (décroissante). Ex : variation de la concentration en sulfate d'ammonium au cours d'une dialyse en tube de cellophane. POURQUOI DIMINUE ALORS QUE RETENU ?

Il s'établit un équilibre de concentration pour la substance diffusante entre le solvant et le contenu du sac de dialyse. L'efficacité de l'élimination d'une substance et sa durée sont conditionnées pat l'importance du volume du milieu externe.  

Quand le rapport : vol solvant / vol sol à dialyser → est grande plus la concentration du soluté est basse.  

[pic 3]

Point rouges = sel          Points bleus = protéines

Buffer = tampon

II.filtration

- Filtration membranaire : le gradient de pression est la force motrice. Les différents procédés de séparation sont basés sur la différence de pression qui permet le transfert des substances diffusibles au travers d'une mb.             

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