Les enzymes

UE GG – Paule Seite

Partie 1 : Les enzymes

Table des matières

I.Les nucléases        2

1. Endonucléases de restriction        2

1.1.Les enzymes de restriction de classe II        3

A.Extrémités cohésives 5’ sortantes : exemple du site de l’enzyme EcoRI        3

B.Extrémités cohésives 3’ sortantes : exemple du site de l’enzyme PstI        3

C.Extrémités à bords francs (“blunt ends”) : exemple du site de l’enzyme EcoRV        4

1.2. Autres points importants        4

1.3. Enzymes de restriction isoschizomères        4

II.Les phosphatases et kinases        5

1. Phosphatase alcaline        5

2. Polynucléotide Kinase        5

3. Applications        6

III.Les polymérases        7

1.ADN polymérases        7

2.ADN polymérase I : ADN pol I (E.coli)        7

3.Fragment de Klenow (issus de l’ADN pol I)        7

4.ADN polymérase du phage T4        8

IV.Autres enzymes utiles        8

1.ARN polymérases        8

2.Rnase        8

3.Nucléases        8

1. Les nucléases

Activité nucléase = Coupure des liaisons phosphodiester

Les nucléases sont des enzymes qui agissent sur les acides nucléiques. Leur activité est une activité enzymatique qui permet de rompre les liaisons phosphodiester (liaison associant le 3' d'un ribose avec le groupement phosphate du nucléotide suivant). Ce n'est donc pas une dénaturation de l'ADN.

- Activité exonucléases : coupure au niveau des extrémités de la molécule

- Activité endonucléases : coupure interne.

1.  Endonucléases de restriction

        Ce sont des enzymes d'origine procaryote (issues des bactéries). Les cellules procaryotes peuvent être attaquées par des bactériophages qui, pour se multiplier, doivent utiliser la machinerie de la cellule hôte. Les endonucléases de restriction sont alors capables de reconnaitre l'ADN du bactériophage et agissent sur l'ADN comme des ciseaux de façon à dégrader l'ADN phagique en petits morceaux. Elles sont les premières barrières à l'infection par des bactériophages. Les endonucléases de restriction ne sont pas actives sur la cellule hôte car il y a des méthylations sur l'ADN chromosomique : ce sont des spécificités de substrat (ADN sp/db). Elles coupent l'ADN double brin au niveau d’une séquence spécifique de l'ADN : elles ont chacune une spécificité de coupure.

• Spécificité de substrat : ADN double brin (DS/DB)

• Spécificité de coupure : séquences spécifiques

Il existe 3 classes d’endonucléases de restriction :

• Classe I :

- Reconnaissance de séquences spécifiques mais clivage aléatoire et à distance du site reconnu.  

- ATP dépendantes.    

- Hydrolysent l’ADN non méthylé.  

- Capable de méthyler certaines bases du site de reconnaissance.

• Classe II :

- Reconnaissance de séquences spécifiques et clivage spécifique dans ces séquences.

- Ne nécessitent pas d’ATP

- Ne modifient pas l’ADN (méthylation..).

• Classe III : 

- Reconnaissance de séquences spécifiques mais clivage aléatoire dans ou à proximité du site reconnu.

- ATP dépendantes.

1. Les enzymes de restriction de classe II

Séquences de reconnaissance: 

- En moyenne 4 à 8 pb

- Coupures toutes les 256 (44) à (46) 4096 bp (en moyenne)

- Palindrome (symétrique) :[pic 1]

1. Extrémités cohésives 5’ sortantes : exemple du site de l’enzyme EcoRI

        (ou sortantes ou sticky ends ou protruding )

La spécificité de coupure fait que l'enzyme coupe toujours entre le G et le A. Cela permet de générer des fragments partiellement simples brin.[pic 2]

On dit extrémités 5' sortantes car lorsque les doubles brins ont été coupés, on se retrouvent avec 4 simples brins. Le côté de deux de ces brins ressortent plus (sont plus long que les autres) donc on dit qu’ils sont débordant ou sortant.

De plus, le terme d’extrémités cohésives correspond à une extrémité simple brin d'un acide nucléique double brin. Cette extrémité dépasse le double brin et peut s'apparier à un autre double brin et être ressoudée par une ligase. Ces extrémités permettent de construire de l'ADN recombiné en génie génétique.

1. Extrémités cohésives 3’ sortantes : exemple du site de l’enzyme PstI

Idem que pour les extrémités 5’ sortantes sauf qu’ici c’est le coté 3’ de deux des 4 fragments qui est plus long après la coupure par l’enzyme.[pic 3]

1. Extrémités à bords francs (“blunt ends”) : exemple du site de l’enzyme EcoRV

 coupe la molécule franchement sur A et T.[pic 4]

1.  Autres points importants

• Enzymes reconnaissant des cibles de 8, 10, 12 bp.  

• Les enzymes de restriction peuvent être sensibles ou non à la méthylation de l’ADN

- HpaII (Hemophilus parainfluenzae)  C/CGG  : coupe l’ADN s’il est non méthylé sur le C (CpG), ne coupe pas si méthylation sur le C (CpG).

- MspI  (Moraxella species) C/CGG : insensible à la méthylation sur le C (CpG)

1.  Enzymes de restriction isoschizomères

Enzymes de restriction d’origines différentes qui reconnaissent  une même séquence nucléotidique.

        Elles provoquent des coupures identiques : 

...