TP localisation d’une enzyme dans le foie de rat

TP localisation d’une enzyme dans le foie de rat

But :

Le but de ce TP est de déterminer la localisation d’une enzyme, la déshydrogénase glutamique (GDH), dans le foie de rat. Pour cela, nous allons réaliser un fractionnement subcellulaire partiel et un dosage protéique afin de mesurer l’activité enzymatique de la GDH.

Principe :

• Fractionnement subcellulaire :

La méthode de fractionnement subcellulaire consiste à séparer les différents composants cellulaires par destruction de la membrane plasmique, puis par désorganisation de la cellule.

Cette méthode se fait en 2 étapes : homogénéisation et purification.

Le but de l’homogénéisation est de rompre la membrane plasmique (ou la paroi pour les cellules végétales et fongiques). Pour se faire, on met les cellules en suspension dans un tampon de pH et de force ionique connus.

L’homogénéiseur est un tube de verre dans lequel on place la préparation puis un piston en verre. La cellule passera entre le tube de verre et le piston, sera ainsi comprimée et éclatera, libérant son contenu dans le tampon.

Une fois la solution homogène, nous réalisons la purification qui est une succession de centrifugations différentielles. La première est celle de l’homogénat obtenus afin de séparer les cellules non broyées, les restes de membrane plasmique et les noyaux qui seront retrouvés dans le culot et le surnageant contenant tous les organites et protéines cellulaires qui va de nouveaux être centrifugée plusieurs fois en augmentant la vitesse et le temps de rotation. Ces différentes centrifugations vont permettre grâce à une augmentation de la force centrifuge de séparer les composants restant en fonction de leur masse et de leur volume. Ceux-ci vont alors soit sédimenter au fond du tube utilisé soit rester dans le surnageant.

Notre TP nous demande de nous arrêter à l’étape 2 de la centrifugation différentielle, nous disposons donc :

• De l’homogénat noté (H) contenant tous les organites cellulaires.

• Du culot 2 noté (C2) contenant les mitochondries.

• Du surnageant 2 noté (S2) contenant les lysosomes, les microsomes et le cytosol.

• Du surnageant 1 noté (S1) contenant les organites du culot 2 et du surnageant 2 réunis.

L’analyse des différentes fractions permettra de cibler précisément la localisation du GDH au sein de la cellule hépatique de rat.

• Schéma d’un fractionnement subcellulaire complet :

[pic 1]

• Schéma du fractionnement subcellulaire partiel réalisé au cours du TP :

[pic 2]

Résultats :

• Dosage des protéines par la méthode du biuret :

 Dans un premier temps, nous avons effectué un dosage protéique des fraction H, S1, C2, S2 par la méthode de biuret. Cette méthode est un dosage colorimétrique des protéines. En présence de CuSO4, les protéines vont former un complexe avec les ions cuivre qui absorbent à 540nm. Ainsi, l’absorbance sera proportionnelle à la quantité de protéines. Pour cela, nous avons réalisé une gamme étalon : (nous avons pris les valeurs du groupe de Mathilde DURIER et Sarah FAUSSURIER car nous nous sommes rendus compte trop tard que notre spectrophotomètre nous donnait des valeurs erronées : toute la première partie jusqu’au tableau de dilution, ce ne sont pas nos valeurs).

Gamme étalon 1 :

Tableau des valeurs de la gamme étalon 1

Exemple de calcul avec le tube B :

[pic 3]

Détermination de la masse protéique dans les essais :

Grâce à la gamme étalon étudiée précédemment, on peut calculer la quantité de protéines présentes dans les fragments suivants :

Tableau de valeurs pour les 4 fractions :

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