Localisation d’une activité enzymatique dans le foie de rat

Compte rendu de TP de biologie métabolique

Localisation d’une activité enzymatique dans le foie de rat

Le but de ce TP est de déterminer la localisation de l’activité de la déshydrogénase glutamique, GDH, dans le foie de rat.

C’est une enzyme qui catalyse la réaction suivante :

[pic 1]

Pour cette détermination, on réalise un fractionnement subcellulaire partiel et deux types de dosages pour une analyse quantitative et qualitative des fractions obtenues. Un dosage des protéines par la méthode du Biuret et un dosage enzymatique de l’alpha-cétoglutarate.

Ces dosages permettent de doser l’activité de la GDH et ainsi en déduire sa localisation.

Principe de ce TP

• Le fractionnement subcellulaire :

C’est une technique de purification qui repose sur une séparation des organites intracellulaires par destruction de la membrane plasmique. On obtient ainsi un homogénat qui donnera par désorganisation de la cellule suite à une centrifugation, les fractions C1 et S1. La centrifugation de la fraction S1 donnera deux autres fractions C2 et S2. La séparation des différentes particules cellulaires se fera en fonction de leur volume et de leur masse.

Le fractionnement subcellulaire est donc réalisé en deux parties, la deuxième dépend de la première.

• Première étape : Homogénéisation

Le foie est maintenu dans de la glace afin de bloquer l’activité enzymatique et dans une solution tampon de Tris-HCl à 10mM et pH 7,4 afin de maintenir l’échantillon dans de bonnes conditions osmotiques. Tout le matériel dont nous aurons besoin est rincé avec la même solution tampon que le foie afin d’être dans les mêmes conditions partout.

Cette étape permet de détruire  la membrane plasmique.

L’échantillon découpé en petit morceau et baignant dans une solution tampon est homogénéisé à l’aide d’un potter Elvejhem muni d’un piston en Téflon, les cellules sont comprimées et finissent par éclater ce qui libère le contenu cellulaire dans le tampon et permet d’obtenir une suspension homogène. C’est l’homogénat.

• Deuxième étape : centrifugations différentielles

Avec l’homogénat on réalise une purification par centrifugation différentielle,  c’est une méthode de séparation des particules cellulaires en fonction de leur densité et leur taille. Elles sont soumises à un champ de force gravitationnelle élevé, 600g et 9000g, cette accélération permet d’augmenter la vitesse de séparation des composés.

Pour ceTP, l’échantillon de foie de rat avait une masse de 13,3g, nous l’avons solubilisé dans 106,4mL de tampon de saccharose 0,25M  et de Tris-HCl 10mM, pH7,4, c’est un tampon osmotique.

L’homogénat a donc un volume de 106,4mL et nous avons prélevé 14mL pour les analyses.

Ainsi, 92,4mL de l’homogénat sont placés dans la centrifugeuse.

La première centrifugation est réalisée pendant 10 minutes à 600g, elle permet d’isoler les constituants les plus lourds, soit les noyaux et les cellules non broyées,  dans le culot 1 que nous ne prendrons pas en compte durant ce TP. Ce culot a un volume de 10,4mL.

Le surnageant 1 est aussi obtenu lors de cette première centrifugation, d’un volume de 82mL, il contient toues las autres particules cellulaires. 27mL de cette fraction servira aux analyses, 55mL sont donc placés dans la centrifugeuse.

La deuxième centrifugation est réalisée à 9000g pendant 10 minutes, elle permet de sédimenter les mitochondries dans le culot 2 avec un volume de 8,5mL.

Le surnageant 2, contenant les organites plus légers comme l’appareil de Golgi, a lui un volume de47mL.

On obtient de cette manière 4 fractions que nous analyserons dans la suite du TP, en réalisant différents dosages afin de déterminer le taux d’activité enzymatique et ainsi déterminer la localisation de l’enzyme dans le foie de rat.

[pic 2]

Résultats

• Préparation des fractions cellulaires

La masse de foie était de 13,3g, nous savons qu’il faut 8mL de tampon par gramme de foie lors de l’homogénéisation. Nous avons donc 13,3g*8mL/g soit 106,4mL de tampon.

• Dosage des protéines par la méthode du Biuret

Dès l’obtention des 4 fractions cellulaires on réalise une gamme étalon d’ovalbumine pour réaliser un dosage colorimétrique pour déterminer la concentration protéique dans les fractions H, S1, C2 et S2.

La gamme étalon nous permet de déterminer les volumes des fractions à utiliser lors des incubations ultérieures  ainsi que les concentrations protéiques.

On obtient :

[pic 3]

Le tube A correspond au blanc du réactif, il nous permet d’effectuer le zéro du spectrophotomètre et ainsi de négliger l’activité des réactifs dans les autres tubes.

On peut donc calculer la quantité de protéine, soit la quantité d’ovalbumine, par exemple pour le tube B :

On à 0,1mL d’ovalbumine à 5mg/mL, pour calculer une masse, la formule est la suivante,

Masse = Volume x Concentration massique

Ainsi Masse oval.B = 0,1 x 5 = 0,5mg d’ovalbumine dans le tube B.

On procède de la même manière pour les 4 autres tubes de la gamme étalon et on peut alors tracer la représentation de la gamme étalon DO540nm = f (quantités ovalbumine).

Graph 1.

La représentation de la gamme étalon nous permet de calculer la concentration protéique dans les essais.

Pour cela, on calcule tout d’abord la quantité d’ovalbumine dans les tubes à essais en calculant la pente de la portion linéaire de la gamme.

Ensuite, pour trouver la concentration protéique, on divise la quantité d’ovalbumine par le volume de la fraction transvasé dans le tube.

Pente a = y/x

Soit, entre deux points, ici F (2,5 ; 0,159) et A (0 ; 0) on obtient,

[pic 4]

On peut maintenant en déduire la quantité protéique, par exemple dans le tube H 0,05 :

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