Tp Digestion d’ADN plasmidiques par des enzymes de restriction

Compte rendu de TP : Digestion d’ADN plasmidiques par des enzymes de restriction

Introduction :

Le but de ce tp est de mettre en place la digestion d’ADN plasmidiques issus de deux clones différents, par différentes enzymes de restriction et ainsi pouvoir déterminer si le clonage a réussi. Pour cela, nous allons réaliser la digestion de l’ADN puis effectuer une électrophorèse.

Matériel et méthodes :

Pour faire ce tp, nous allons utiliser des ADN plasmidiques issu de deux clones différents pUC-L1 et pUC-L2 fournis en solution à 0,5 µg d’ADN/µl.

Nous allons également utiliser deux enzymes de restriction, soit EcoR1 et HindIII fournies à la concentration de 1 unité/µl et placées dans des solutions tampons adaptées à concentration 10x.

Nous allons tout d’abord effectuer la digestion de chacun des deux ADN plasmidiques dans un volume réactionnel final de 20 µl par HindIII , par EcoR1 et par HindIII et EcoR1, en utilisant 1 unité d’enzyme/µg d’ADN. On utilise donc six tubes (trois pour chaque ADN) pour six digestions.

Ces digestions sont ensuite incubées pendant une heure à 37°C (voir le tableau des résultats).

Après l’incubation, nous passons à l’étape suivante qui est de séparer les fragments de restriction par électrophorèse. L'électrophorèse sur gel est une technique capable de séparer des fragments d'ADN de quelques centaines de nucléotides dont les longueurs ne diffèrent que d'un seul nucléotide.

Pour commencer il faut préparer le gel d’électrophorèse : nous avons pesé 1g d’agarose et ajouté 100 mL de tampon d’électrophorèse TEA. Ensuite nous avons dissout l’agarose en chauffant l’ensemble à 100°C. Puis nous avons coulé sur le support approprié et un peigne ajouté pour former les puits de dépôt des échantillons. Nous avons ensuite laissé refroidir et retiré le peigne lorsque le gel est devenu solide, puis nous avons placé le gel et son support dans la cuve d’électrophorèse en immergeant les puits.

Une fois la réaction enzymatique terminée, nous avons ajouté 2 µl de solution de dépôt composée de glycérol, de bromure d’éthidium (BET) qui sert à visualiser l’ADN et de bleu de Bromophénol dans les échantillons.

En parallèle nous avons préparé deux tubes contenant 1µ d’ADN natif (non digéré) et 2µl de la solution de dépôt dans un volume final de 20µl.

Nous avons ensuite déposé ces différentes préparations sur le gel d’agarose 1% selon un ordre précis (voir ordre des dépôts) puis fait migrer pendant une heure et observé le gel sous une lampe à UV, les fragments d’ADN sont devenus visibles (ils sont fluorescents).

Ordre des dépôts (de gauche à droite) :

Piste 1 : ADN plasmidique pUC-L1 natif (1 µg d’ADN)

Piste 2 : ADN du clone pUC-L1 coupé par HindIII

Piste 3 : ADN du clone pUC-L1 coupé par EcoR1

Piste 4 : ADN du clone pUC-L1 coupé par HindIII et EcoR1

Piste 5 : M, marqueurs de tailles

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