Compte rendu de TP : Séparation d’ADN par électrophorèse analytique et préparative.

Sinouvassane Vijayakoumar, NGUYEN Anh-Phuong                                        

Séquence 4, Groupe A2                         

1) Objectifs

Nous voulons extraire un plasmide à partir d’une culture bactérienne afin d’isoler le gène Wzc présent dans ce plasmide. Pour cela, nous allons d’abord extraire le plasmide de la culture, ensuite établir sa carte de restriction, et enfin isoler ce gène.

Nous allons pour cela utiliser plusieurs techniques telles que la centrifugation, l’électrophorèse et la chromatographie échangeuse d’anions.

2) Principe

2.1.Préparation de l’ADN plasmidique

Pour extraire les plasmides des bactéries, nous effectuons à plusieurs reprises des centrifugations associées à des ajouts de produits.

La centrifugation est une technique préparative qui permet de séparer les organites subcellulaires ou des macromolécules organiques selon leur différence de densité et de leur taille. Par conséquent, les molécules ayant une densité élevée seront au fond du tube (culot) et les plus légers à la surface (surnageant).

Par ordre chronologique, nous ajoutons du lysozyme pour rompre les parois bactériennes (peptidoglycane et paroi cellulaire compris) et ainsi obtenir le contenu de la bactérie (surnageant). Ensuite on récupère ce surnageant et on y ajoute de la soude pour rendre le milieu alcalin, associé à du SDS pour dénaturer l’ADN (rupture des liaisons hydrogène) et éliminer les ARNs.

Enfin on renature l’ADN plasmidique en acidifiant le milieu. Puis, on centrifuge avec de l’éthanol ce qui précipitera l’ADN plasmidique dans le culot. Le phénol et chloroforme permet de dégrader les protéines.

2.2.Carte de restriction

Une carte de restriction est nécessaire pour déterminer la position relative des sites de coupure entre eux. Pour cela, nous utilisons des enzymes de restriction qui ont leur propre site de coupure spécifique au sein du plasmide. On s’aide pour cela d’une électrophorèse.

L’électrophorèse est une technique analytique qui permet de séparer un mélange de molécules chargées par migration dans un champ électrique. Les acides nucléiques étant chargés négativement dû au groupement phosphate, à pH physiologique, migreront tous de la cathode (-) à l’anode (+). La séparation dépendra donc uniquement du poids moléculaire. Notre support est le gel d’agarose qui, dans notre TP, pourra être à 0,8% ou 1%. Plus la concentration en agarose est élevée, plus les mailles (tamis) seront petites donc plus la séparation sera faite pour les molécules de petite taille. Et, à l’inverse, moins la concentration en agarose est élevée plus on séparera de grosses molécules.

Cette concentration du gel définit notre domaine de résolution. Les molécules trop grosses ou trop petites ne pourront être comprises dans notre domaine de résolution si elles n’appartiennent pas la gamme de proportionnalité. Cette gamme sera déterminée grâce à des marqueurs de taille connus. Afin de faire migrer les molécules sur ce gel, on utilise un tampon de migration TBE qui permet de garder un pH constant. L’EDTA (Éthylène Diamine Tétra-Acétique) qui permet de capter les ions MG 2+ est indispensable au bon fonctionnement des enzymes de restrictions.

La révélation de la migration des fragments d’ADN, se fera sous UV, grâce au bromure d’éthidium(BET), agent s'intercalent entre les bases d’ADN, ce qui entraîne un changement de sa conformation permettant une émission de fluorescence lorsqu’il est excité.

                        2.3.Isolement et purification du fragment EcoRI/BamHI

A la suite de l’électrophorèse, on a récupéré le fragment d’ADN d’intérêt.

Pour récupérer l’ADN plasmidique, on fait une chromatographie échangeuse d’anions. C’est une technique de séparation et de purification de molécules chargées en fonction de leur charge. Ici, la phase stationnaire est constituée de cations (molécules chargées positivement). Les molécules chargées négativement se fixeront sur la colonne (phase stationnaire) tandis que les molécules neutres ou chargées positivement seront éluées de suite. Sachant que nos acides nucléiques sont chargés négativement grâce aux groupements phosphates, ils seront donc fixés sur la colonne. On les éluera par un tampon d’élution pour récupérer l’ADN plasmidique. C’est grâce à cette méthode que nous allons pouvoir purifier notre gène d’intérêt wzc.

3) Résultats et analyses

                3.1.Carte de restriction

Nous avons utilisé un gel d’agarose à 1%. (La relation entre la concentration en agarose et le domaine de résolution est expliqué dans les principes).

Nous traçons d’abord la droite étalon f(Distance de migration) = log PM à partir de la piste des marqueurs de taille connus (Annexe 1).

Grâce à cela on obtient la gamme de proportionnalité ainsi que l’équation de la droite. Cette dernière nous permettra de calculer les tailles des fragments issus des puits de l’électrophorèse.

On détermine notre zone de linéarité. On estime que la droite est linéaire pour des distances allant de 2,2 cm à 5,05 cm.

Analyses des pistes (ANNEXE 2)

• Pistes 7 et 8: Nous obtenons deux bandes, donc deux fragments de 2872 pb et 2405 pb. Ces enzymes possèdent chacune un site de restriction dans le plasmide, et cette digestion enzymatique permet de couper exactement le gène wzc. Nous savons que c’est la bande du bas, donc wzc fait 2405 pb. Dans le puits n° 8, il y a 9 fois plus d’ADN plasmidique hautement concentré que dans le puits n°7. La fluorescence est d’ailleurs beaucoup plus importante que dans le puits 7.

Grâce à cette dernière, nous déterminons la taille totale de notre plasmide, les 2 distances de migration étant situées dans notre domaine de linéarité. On obtient :

Taille totale du plasmide = 2872+2405=5277 pb.

• Piste 1 : On obtient une seule bande qui se situe à 1,9 cm, ce qui est normal puisque le puit ne contient que le plasmide (ADN circulaire).
• Piste 2 (Sall) : On obtient une bande située à 1,8 cm après application de SalI. L’ADN peut avoir plusieurs conformations, circulaire ou linéaire (superenroulé ou relaché). Ces conformations peuvent jouer sur la distance de migration puisque le tamis (gel d’agarose) retient les molécules plus grandes. Il y a donc une différence de conformation entre la piste 1 et 2. On peut supposer que notre ADN est relaché ce qui expliquerait une distance de migration plus courte, la conformation superenroulé étant plus condensé migrera plus loin que la conformation relaché. On a donc un seul site de restriction Sall.
• Piste 3 (PvuI) : On obtient 2 fragments dont un qui se situe dans notre domaine de linéarité. Cela signifie que le plasmide a 2 sites de restriction à PvuI. Le plus petit fragment se situe à 4,7 cm soit 1374 pb (calculé à partir de l’équation de la droite). Sachant que notre plasmide entier fait 5277, on peut calculer la taille de l’autre fragment qui n’était pas dans la zone de linéarité. On obtient 5277-1374=3903 pb.
• Piste 4 (Sall + Pvul) : Nous obtenons 2 bandes sur cette piste. Une de ces bandes a migré à la même distance (4,7 cm) que la bande correspondant à 1374 pb de la piste 3. On remarque que la bande la plus haute a plus migré que la bande la plus haute de la piste 3. Donc, on en déduit qu’un petit fragment a été coupé mais n’apparaît pas sur notre électrophorèse du fait de sa très petite taille (soit il est sorti du gel soit il est trop petit pour que suffisamment de BET puissent s’intercaler). Grâce à la piste 3, nous pouvons déterminer la taille de ce petit fragment qui est égal à 3903-3430=473 pb. Cela signifie que le site SahI est très proche d’un des deux sites PvuI.
• Piste 5 (Sall + Mlul) : Nous obtenons qu’une seule bande qui est en dehors de notre domaine de linéarité. Normalement, nous devrions obtenir 2 bandes avec un gros fragment et un petit fragment. (Nous nous sommes donc référés sur l’électrophorèse d’un camarade pour ce résultat).Cela nous permet de déduire qu’il y a une seul site de restriction à Mlul sachant qu’on a également un site à Sall et que le site Mlul est situé proche du site SalI.  

• Piste 6 (PvuI + Mlul) : Nous obtenons 3 bandes. Après calcul, nous avons une bande à 3258 pb, une à 871 pb et une à 1148 pb. La bande à 1148 pb devrait être la bande situé à la même distance de migration que la bande à 1374 pb des pistes 3 et 4. Cette erreur de 200 pb environ est sans doute dû à nos nombreuses approximations que ce soit la gamme de linéarité, la mesure des distances de migration ainsi que nos manipulations. Cette bande correspond au fragment situé entre les sites PvuI.
• Mise en commun des pistes et déduction de la carte de restriction : Nous avons 2 sites Pvul séparés par 1374 pb. Nous avons déterminé la taille du petit fragment grâce à l’étude des puits 3 et 4 et en avons déduit que le site Sall est proche d’un des sites Pvul. Ensuite avec l’aide de la piste 5, nous savons que Mlul est proche d’un site Sall (cependant pour notre cas, nous n’obtenons qu’une seule bande au lieu des 2 qu’on devrait avoir. De plus, nous ne pouvons pas déterminer la taille de ce fragment n’étant pas dans la gamme de linéarité). On ne pourra placer exactement Mlul mais on saura déterminer approximativement sa position relative.  Puis, avec la piste 6, nous obtenons une bande à 1148 pb qui correspondrait à la bande à 1374 pb des pistes 3 et 4. On a donc la confirmation que le fragment situé entre les 2 sites Pvul reste entier donc que les sites Sall et Mlul sont situés à l’extérieur de ce fragment.

                3.2.Purification et calcul du rendement

Nous avons récupéré notre gène d'intérêt à partir de l’électrophorèse se situant dans la bande ayant le plus migré des puits 7 et 8. On l’a prélevé du puits 8 qui contient 9/10e de la quantité du gène total.

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