Enzymes de restriction cas

Virginie et Julian                             Rapport de Biologie                                     11.04.2016                                                                                                                                                           

______________________________________________________________________________

Les enzymes de restriction

1. But de l'expérience :    

        Lors de cette expérience, nous allons étudier la digestion d'ADN par les enzymes de restriction MspI et BamHI sur les plasmides pUC19 et pUC19-TIF1, cela en séparant par électrophorèse sur gel d'agarose les différents fragments d'ADN obtenus.

1. Introduction théorique : 

On associe souvent les bactéries à des organismes néfastes, mais ceci n'est pas tout à fait vrai. Même si certaines peuvent causer des maladies graves, qui font de nos jours encore beaucoup de dégâts, comme la tuberculose, la plupart des bactéries sont essentielles sur terre. En effet, ce sont des décomposeurs qui permettent de recycler la matière organique morte. On les retrouve dans un grand nombre de milieux différents, que ce soit dans les profondeurs océaniques ou dans notre corps, où elles nous aident à nous protéger des autres bactéries ainsi qu'à digérer. Elles possèdent une très grande diversité, en effet rien que leur taille peut varier entre 50 nm et 750 μm. En revanche, toutes les bactéries ont en commun le fait qu'elles n'ont pas de noyau. Leur génome est constitué d'ADN chromosomique. Elles peuvent également posséder un ADN circulaire extrachromosomique de petite taille appelé plasmide.

Les plasmides se multiplient indépendamment de la division cellulaire. Ceux-ci sont des éléments clés, à la fois pour les bactéries elles-mêmes, mais pour nous également. En effet, ils sont de véritables atouts pour les bactéries, car ils sont essentiels pour leur adaptation. Ceci s'explique par le fait que les gènes portés par les plasmides codent pour différentes protéines qui ont plusieurs fonctions. Certaines protéines peuvent permettre à la bactérie de résister aux antibiotiques, d'autres aux métaux lourds. Il existe donc plusieurs types de plasmides qui sont chacun à leur manière utiles pour la bactérie. Si le plasmide de celle-ci ne lui est plus utile, elle le perd. Pour qu'une bactérie garde son plasmide, il faut donc la forcer à le garder.

Les plasmides ne sont donc pas seulement de véritables pépites pour les bactéries, mais également pour nous. Grâce à eux, on peut transformer les bactéries en de véritables usines. On s'en sert notamment pour bénéficier de médicaments, qui avant étaient difficiles à trouver, ou alors qu'on allait chercher sur des cadavres. En créant des plasmides recombinants  (plasmide coupé sur un site spécifique par une enzyme de restriction et où on a ensuite inséré un autre morceau d'ADN) on fait en sorte que la bactérie intègre ce plasmide, le garde et ensuite travaille pour nous en produisant la substance recherchée.

Cette micro-usine bactérienne qui fonctionne par le biais de plasmides recombinés peut aussi faciliter le séquençage génétique. En effet, on peut créer un plasmide recombinant avec l'ADN que l'on veut séquencer ainsi que l'ADN du plasmide de base. Ce plasmide recombiné va se multiplier un grand nombre de fois par l'intermédiaire de notre usine bactérienne et en définitive, il ne nous restera plus qu'à séparer l'ADN du plasmide de l'ADN que l'on veut séquencer et on aura par conséquent une grande quantité de notre ADN à séquencer.

Pour notre expérience, nous allons utiliser un plasmide pUC19 qui, comme nous pouvons le voir sur l'image à la fin de notre introduction, possède un gène de résistance à l'ampicilline Apr, ainsi qu'un gène lacZ codant pour la Bêta-galactosidase. Ce plasmide possède 2'686 paires de bases. Nous allons également utiliser un second plasmide, le pUC19-TIF1, qui est presque semblable au pUC19, sauf qu'il possède en plus un fragment d'ADN de levure qui a été inséré dans le gène lacZ, plus particulièrement sur le site de restriction de l'enzyme BamHI. En effet, pour créer le plasmide pUC19-TIF1, on a ouvert le pUC19 sur le site de restriction de BamHI et ensuite on a inséré le gène TIF1 avant de refermer le nouveau plasmide. Ce plasmide est donc un plasmide recombinant. Le pUC19-TIF1 possède 8'297 paires de bases. Nous pouvons également voir sa représentation sur la figure en fin d'introduction.

Lors de notre laboratoire, nous allons couper ces deux plasmides, grâce à des enzymes de restriction. Ce sont des protéines qui sont capables de reconnaître et de couper une petite séquence de nucléotides spécifiques (entre 4 et 10 paires de bases) et ainsi d'isoler certains fragments d'ADN. Elles coupent donc des fragments d'ADN sur des sites appelés sites de restriction. Grâce à ces sites, nous pouvons établir des cartes de restriction qui répertorient les différents sites de restriction. Nous pouvons voir la carte de restriction utile à notre expérience en fin d'introduction. Les enzymes de restriction  sont présentes naturellement chez beaucoup d'espèces de bactéries, qui les utilisent comme véritables moyens de protections contre les attaques des bactériophages. En effet, ces enzymes coupent l'ADN viral de l'envahisseur, mais pas celui de la bactérie, qui peut pour cela remercier la méthylase. Les enzymes de restriction sont pratiques afin d'établir des cartes génique (carte de restriction), de couper et d'isoler certains fragments d'ADN et de créer des nouvelles combinaisons d'ADN. Elles sont donc des outils très importants de la biologie moléculaire, qui ont permis l'avènement du génie génétique.

Pour notre laboratoire, nous allons utiliser deux enzymes de restriction différentes. L'enzyme MSPI qui reconnaît la séquence de nucléotides CCGG et qui provient de Moraxella species. Cette enzyme coupe en moyenne toutes les 256 paires de bases. Nous allons aussi utiliser l'enzyme BamHI qui elle, reconnaît la séquence GGATCC et qui vient de Bacillus amyloliquefaciens. Celle-ci coupe toutes les 4096 paires de bases.

[pic 1]

Figure 1

Nous pouvons voir grâce à la figure 1, qui représente les cartes de restriction des plasmides pUC19 et pUC19-TIF1, les sites de restriction pour les enzymes Msp1 et BamHI. Nous pouvons également voir le nombre de fragments de chaque plasmide que nous sommes censés obtenir, ainsi que leur taille.

...