Enzyme tp

Dans le tp de biologie moléculaire, on a réalisé une mutagenèse dirigée afin de modifier à la positon 42 l'acide aminé Q en N pour créer la variante de la dsredT3. Dans ce tp, nous analyserons une étude comparative entre cette variante dsRed T3 et la dsredM qui est une souche mutée.

Objectif du tp : À l'aide de la technique de purifications des protéines, de l'électrophorèse, et de la western blot, nous allons faire une étude comparative entre les variants de la dsredT3 et la dsredM.

Protocole expérimentale

Extraction des protéines dsredM et dsredT3

Deux trinômes reçoivent soit les bactéries contenant les plasmides DsRedT3 soit celles contenant les plasmides DsRedM.

Notre trinôme a travaillé sur la protéine sauvage dsredT3.

On remarque que la protéine sauvage était rouge alors que la protéine mutée était blanche.

On commence l'étape d’extraction des protéines qui consiste à isoler les protéines des bactéries d’E. Coli d’autres débris cellulaires. Pour cela, les bactéries sont baignées dans un 1mL de tampon de lyse (Tris-HCl 50mM pH 8 1,5% lauryl-sarcosine) au pouvoir détergeant qui permettra la destruction de toutes membranes, libérant ainsi les protéines intracellulaires et membranaires.

Ensuite pour récupérer les protéines, on réalise trois impulsions de sonication de 10 secondes espacées de 30secondes. On incube sous agitation pendant 15min à température ambiante, puis on refait une deuxième étape d’impulsions de sonication identique à la première. On centrifuge à 5000rpm pendant 10min afin de récupérer le surnageant qui correspond aux constituants cellulaire de masse faible. On nomme cette extraction bactérienne EBT3+ car çest le plasmide dsredt3 en présence d’IPTG.

2. Purification des protéines dsredT3 et dsredM

Après avoir extrait les protéines de la souche bactérienne sauvage, nous allons la purifier à l'aide de la technique de chromatographie d’affinité sur colonne de nickel en exploitant l’affinité que l’histidine possède pour les métaux, grâce à son noyau imidazole. C’est pour cette raison qu’une séquence polyhistidine a été rajoutée dans la séquence des porteines DsRed T3. Cette séquence s’appelle un tag histidine, ou étiquette 6-His.

Sur la résine est fixé un atome de nickel, lui même lié à un ion nickel Ni2+ qui possède six liens de coordination. 3 ou 4 coordinations sont requises pour lui permettre d’immobiliser le nickel sur la résine, en fonction du type de bras de fixation utilisé.

...