Sérum sanguin

TP Biomoléculaire
ARN aptamère produit dans la bactérie

Un aptamère est un oligonucléotide (ADN ou ARN) possédant des propriétés de reconnaissance moléculaire semblables aux anticorps. Il est capable de fixer un ligand spécifique et même parfois de catalyser une réaction chimique.
Dans ce TP, nous avons étudier deux molécules d’ARN possédant chacun un aptamère. Ces deux molécules d’ARN étant produits dans la bactérie, il est important d’introduire le terme de système d’expression hétérologue. L’intérêt de cette expression est qu’elle va nous permettre de surproduire des molécules qui nous intéresse et qu’on veut étudier. Il n’y aura donc pas de problème d’approvisionnement. On aura une protéine de manière reproductible et contrôlée. La bactérie va considérer la séquence hétérologue comme sienne, et par la suite ces bactéries seront sélectionnées en présence d’antibiotique.
Durant le TP nous avons donc dans une première partie procéder à la purification d’un complexe ARN/protéine co-produit dans la bactérie, et dans une deuxième partie étudiée l’interaction spectrale du vert de la malachite avec l’ARNt/aptamère de la malachite.
Ce compte rendu comportera dans un premier temps une observation du protocole et des résultats des expériences des deux parties, suivis de leurs interprétations et pour finir, une conclusion.  

Observation :
Première partie :
- Dans cette partie, on a d’abord effectué la préparation du gel d’électrophorèse.
Il faut en premier lieu procéder à l’installation du système de moulage car c’est dedans qu’on verse notre préparation.
La préparation du gel à 14% d’acrylamide s’est faite en 2 temps : d’abord la préparation du gel de séparation qu’on laisse polymériser puis ensuite la préparation du gel de concentration (stacking) qu’on coule par-dessus le gel de séparation et qu’on laisser ensuite polymériser. Pour les deux préparations, il faut verser les 10 uL de TEMED impérativement en dernier dans le mélange Tampon-Tris, APS, SDS (rôle de ces éléments expliquer dans Interpretation) ... et le couler directement dans le moule.
- On a ensuite effectué une casse bactérienne où on resuspend note culot bactérien avec 1,5 de solution de casse (contenant également la protéine de la capside) et qu’on met dans un bac à glace, puis au sonicateur et qu’on place ensuite dans une centrifugeuse. A la suite de cela, on récupère ensuite 10uL d’aliquot pour l’analyse (S) auquel on rajoute 10uL de tampon de Laemmeli.
- Viens ensuite l’étape de purification où on a effectué plusieurs étapes successives afin d’avoir une gamme étalon. La phase a été équilibré avec 10ml de tampon tris, NaCL. On a obtenu un premier tube FT : le surnageant de centrifugation a été déposer dans la colonne puis a été débouché afin de récupérer les éléments qui passe à travers, on rajoute ensuite 10uL de tampon Laemmli. On procède ensuite à une série de lavages et on obtient 2 tubes de lavages (L1 et L2), en mettant 5mL de tampon Tris dans la colonne, NacL auquel on ajoute à la fin le tampon de Laemmli. Et 2 tubes de lavages dont on a ajouté en plus de l’imidazole (L1i et L2i). Pour finir, on préparer 2 tubes d’élution (E1 et E2), obtenu en y versant 0,5 de tampon et 1M d’imidazole auquel on ajoute à la fin le tampon de Laemmli.
- On procède alors à l’analyse de la purification sur PAGE-SDS. Lors de la révélation de la présence dARN sous UV, on n’a rien pu observer sur notre gel, contrairement à certains binômes. Après coloration puis décoloration de notre gel pour réveler la présence de proteine, on a toujours pu rien observer. On devait en effet observer ce type de gel 

Deuxième partie : Dans cette partie, on a préparé 20 échantillons à partir du tableau 1 du TP. La quantité de malachite est la même et on y ajouté des quantités croissantes d’ARN (déjà purifiés), ainsi que de l’eau.
On a ensuite placé nos solutions dans un spectrophotomètre UV-visible et pu observer un déplacement du lambda max. Plus la concentration d’Arn est élevé et plus le lambda max de la malachite augmente (de 618 à 632nm). En traçant le graphe sur papier semi-log, on a pu observer une allure sigmoïdale. La Kd fut déterminé en y traçant 2 tangente à la courbe parallèle entre elles, et on lit le résultat sur l’intersection de la droite parallèle équidistant des 2 tangentes.

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