Sérum sanguin

         Le sérum sanguin, provenant de la coagulation du sang, est la partie liquide du sang qui ne contient ni cellules sanguines (globules rouges, blancs, plaquettes), ni fibrinogène. Les protéines sériques sont très nombreuses, mais quantitativement seules quelques-unes d’entre elles composent près de la moitié de la concentration protéiques totale, tels que les immunoglobines et l’albumine.
        L’objectif de ce TP, consiste en une purification des immunoglobulines (Ig) et en parallèle de l’albumine, à partir du sérum de sang humain. Une séparation entre l’albumine liée aux Ig sera faite au préalable afin d’éviter une contamination de la fraction d’Ig lors de la purification. La purification sera suivie quantitativement par la méthode Lowry et par immunodiffusion radiale (IDR) et qualitativement par une électrophorèse en condition dénaturante ainsi que par protéolyse de l’Ig par la pepsine.

Une chromatographie d’exclusion stérique est faite dans un premier temps afin de préparer les Ig et l’albumine semi-purifié à une étape suivante de purification par chromatographie d’échange d’ions pour l’albumine et d’affinité pour les Ig. La chromatographie d’exclusion stérique mettant à profit les différences de solubilité des protéines en présence de fortes concentrations en sel neutre tel que le sulfate d’ammonium. Le sulfate d’ammonium rentre en compétition avec les protéines vis-à-vis des molécules l’eau et se produit à une certaine concentration en sel, une précipitation totale (zone de relargage) permettant de déshydrater les protéines et ainsi de les séparer. Le sel d’ammonium est ensuite éliminé de la fraction globulinique par passage dans la colonne d’exclusion-diffusion de type PD-10 (étape de dessalage). On récupérera ensuite à la sortie de la colonne : PD-10IG et PD-10Alb qui serviront donc pour les chromatographies d’affinité et d’ions respectivement.

Lors de ces deux chromatographies,

I – Analyse quantitatives (Ig et Alb)

Principe de la technique

- Dosage des protéines totales par la méthode de Lowry 

         Cette méthode est une méthode de dosage colorimétrique des protéines et dérivée de celle du Biuret, et plus sensible que cette dernière. Le dosage se fait à travers une gamme étalon, réalisé à l’aide de quantités connues de BSA qui permet de mimer la réaction que la protéine (Ig ou albumine) pourrait avoir. De plus, ce dosage va se faire dans un milieu alcalin contenant du sulfate cuivrique et où l’on introduit le réactif de Folin qui va réagir spécifiquement avec les tyrosines situées sur les protéines et donner une coloration bleue. Ainsi, plus nos tubes sont bleus et plus l’absorbance des protéines sera grande témoignant d’une forte concentration en protéines totales.  

         Pour ce dosage, les fractions PD-10 (Ig et Alb) sont dilués au 1/10 et 1/20 et les fractions FF (protéines fixés Ig et Alb) sont dilués au 1/5 et 1/10. Une dilution de 1/50 du sérum départ est fournie.

Exemple de calcul pour FFig dilué au 1/5 :  CFFIg x VFFIg = C’FFIg x V’FFIg  ⬄ VFFIg  = 1/5 C’FFIg x  V’FFIg
                                                                                                                                                                                                                                                             CFFIg
                                                                                                                                                    = 1/5 x 100 = 20 µL qu’on complète ensuite avec 90 µL de NaCl.      

- Dosages des IgG par immunodiffusion radiale simple (IDR)

         L’IDR ou technique de Mancini, consiste à déposer un antigène dans un puit creusé dans une gélose contenant un antisérum spécifique.  L’antigène diffusera de manière radiale et précipitera après réaction avec l’anticorps formant un complexe anticorps-antigène. On attend un temps suffisant (minimum 24 heures) pour obtenir un dosage précis. Le diamètre du cercle (anneau de précipitation) est proportionnel à la dose d’antigène déposé. On pourra par la suite tracer une droite d’étalonnage : on utilise un étalon d’une concentration connu d’Ig et on pourra chercher la concentration des Ig variable et ainsi donc tracé le diamètre au carré (d²) de l’anneau de précipitation en fonction de la concentration en Ig.

Résultats

- Dosage des protéines totales par la méthode de Lowry 

Après avoir incubé chaque tube pendant 30 minutes dans le noir, il a été observé que les tubes de 1 à 5 viraient du bleu clair à un bleu plus foncé. Les résultats de l’absorbance à 660nm (tableaux) ainsi que les concentrations massiques en protéine totales des échantillions dosés grâce aux droites d’étalonnage établie à l’aide des tubes BSA sont représentés dans l’annexe n°.. pour les Ig et .. pour l’albumine.

- Dosages des IgG par immunodiffusion radiale simple (IDR)

+ Voir annexe n°.. …….…………………………………………………………………………………………………………………………

         Pour avoir la concentration du sérum standard dilué au 1/2, il suffit de diviser par 2 la concentration du sérum standard non dilué, soit : 13/2 = 6,5 g/L. Et pareillement pour le sérum standard au 1/3 où l’on divise par 3.
Après avoir placé 3 points correspondant au sérum standard et les sérums dilués sur le graphe, on peut déterminer la concentration en IgG de FFIg et PD-10Ig. On trouve respectivement 4,4 g/L et 34,2 g/L qu’on divise par 2 car lors de la manipulation, le chargement de ces derniers dans les puits ont été réalisés en deux temps.  

Résultats de l’analyse quantitative

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