Séparation d'ADN par électrophorèse analytique et préparative.

BETANCURT-ANZOLA Léonardo (11412387)                                                                                Groupe A1

CHEMARIN Thibaut (11303242)                                                                          TP réalisé le 09/11/16

SEPARATION D’ADN PAR ELECTROPHORESE ANALYTIQUE ET PREPARATIVE

1. BUT :

L’objectif de ce TP est de purifier de l’ADN plasmidique pUC18-wzc à partir d’une culture bactérienne d’Escherichia coli et d’en extraire le gène wzc préalablement cloné dans ce plasmide.

Pour ce faire, nous allons d’abord extraire le plasmide de la culture, établir sa carte de restriction à partir de différentes digestions enzymatiques contrôlées par électrophorèse analytique et déterminer le rendement de l’extraction. Puis, nous isolerons le gène wzc par double digestion EcoRI / BamHI et nous le purifierons à partir d’une deuxième électrophorèse.

NB : Pour des contraintes temporelles, nous étudierons une solution plasmidique déjà préparée. C’est à partir de cette solution que nous extrairons le gène wzc et que nous réaliserons la carte de restriction du plasmide.

1. PRINCIPES :

1. Préparation de l’ADN plasmidique pUC18-wzc : cycle de centrifugations

L’ADN plasmidique pUC18-wzc est isolé à partir d’une culture bactérienne d’Escherichia coli. Pour cela, nous réalisons une centrifugation visant à re-suspendre le culot bactérien. Puis, nous ajoutons une solution (I) contenant du lysozyme, enzyme qui permet de lyser les parois bactériennes. Nous ajoutons une solution (II) constituée de soude (NaOH) qui dégrade les ARN et rend le milieu alcalin ainsi que de SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) qui dénature les protéines. Une troisième solution (III) contenant de l’acide acétique et de l’acétate de potassium est ajoutée pour renaturer l’ADN.

[pic 1]Pour séparer les contenus obtenus après l’action de ces solutions, nous

[pic 2][pic 3]effectuons des centrifugations. La centrifugation est une technique qui permet de séparer des molécules selon leur densité. Après la 1ère centrifugation, le culot contient des débris cellulaires et de l’ADN chromosomique ; le surnageant contient quant à lui de l’ADN plasmidique et des ARN (l’ADN chromosomique se trouve dans le culot car il est beaucoup plus lourd que l’ADN plasmidique et les ARN). Nous extrayons ensuite les protéines avec du phénol. Les deux centrifugations suivantes permettent de s’assurer que tous les débris cellulaires ont bien précipité dans le culot. Entre les deux, nous éliminons le phénol par action du chloroforme. La 4ème centrifugation avec de l’éthanol permet de précipiter l’ADN plasmidique dans le culot. Au final, nous utilisons une colonne chargée (+) afin d’isoler le plasmide (-). Nous préparons une 2ème fraction où nous ajoutons une RNase A afin de détruire l’ARN possiblement présent. L’ADN plasmidique pourra être sous forme super-enroulée ou circulaire simple (+ relâchée).

1. Etablissement de la carte de restriction par analyse électrophorétique

Afin d'établir la carte de restriction du plasmide, nous allons le digérer par différentes enzymes de restriction et analyser les fragments grâce à une électrophorèse analytique. L’électrophorèse est une technique de séparation des molécules en fonction de leur charge et de leur taille. Elle repose sur la migration de particules chargées dans un champ électrique. Dans notre cas, les acides nucléiques (= AN) chargés négativement du fait de la présence de groupements phosphate ionisés au pH de la solution (pH légèrement basique) migreront vers l’anode (pôle +). La séparation se fait sur un gel d’agarose, support inerte réticulé en mailles plus ou moins importantes en fonction de la concentration en agarose. Plus elle sera élevée, plus les mailles seront petites (séparation de petites molécules) ; la concentration en agarose définie donc le domaine de résolution du gel. La migration des fragments d’ADN dépendra donc de leur taille. Pour que les dépôts migrent sur le gel, nous utilisons du tampon TBE : Tris, Borate et EDTA, pH 8 qui chélate les ions Mg(2+) et protège l’ADN des ligases mais également du BEG (bleu de bromophénol et de xylène cyanol + EDTA + glycérol) qui permet aux dépôts de se loger au fond des puits et de visualiser les migrations par une coloration. La révélation de la migration des fragments se fait sous UV grâce au bromure d’éthidium (BET) qui est un agent s’intercalant entre les bases d’ADN. On observe ainsi une émission de fluorescence.

Pour déterminer la taille des fragments qui ont migré, nous traçons la courbe log(taille) = f(distance de migration) et nous calculons les masses des fragments en appliquant une relation de proportionnalité. Le gel ayant un domaine de résolution défini, nous ne pouvons appliquer cette relation que pour des fragments ayant une taille comprise dans la zone de linéarité du gel.

1. Extraction du gène wzc par chromatographie échangeuse d’anions

Nous réalisons une double digestion du plasmide par BamHI/EcoRI. Ainsi, nous récupérons 2 fragments dont un correspondant au gène wzc. Nous allons le purifier par chromatographie échangeuse d’anions qui est une technique de séparation des molécules en fonction de leur charge. Dans notre cas, la phase stationnaire est cationique (chargée +) et va donc retenir les molécules chargées (-) c’est-à-dire les AN.  Nous récupérerons l’ADN par élution à l’aide d’un tampon adapté.

1. RESULTATS :

1.  Electrophorèse analytique et carte de restriction de pUC18-wzc

1. Carte de restriction du plasmide pUC18-wzc

Afin d’établir la carte de restriction du plasmide pUC18-wzc ; nous allons d’abord analyser les résultats que nous avons obtenus sur notre électrophorèse analytique suite aux différentes digestions par des enzymes de restriction (endonucléases coupant seulement l’ADN double brin au niveau d’une séquence particulière. Ici nous utilisons des endonucléases coupant au niveau de sites de restriction : SalI, PvuI, MluI, EcoRI, BamHI) ; puis nous déterminerons le rôle de chacune des pistes et ce qu’elles indiquent concernant la carte de restriction du plasmide.

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