Etude de la caséine

Etude de la caséine : extraction de celle-ci par précipitation au point isoélectrique, détermination de leur concentration par mesure de l’absorbance de la tyrosine libre constitutive et analyse des acides aminés constitutifs d’un tripeptide par chromatographie sur couche mince

Muller Théo-Bob theo-bob.muller@etu.univ-amu.fr

Coste Thomas thomas.cosee@etu.univ-amu.fr

La caséine est une des plus importantes protéines constitutives du lait. Lors de notre expérience, nous en avons extrait à partir de lait de vache et obtenu des quantités supérieures à celles attendus. Nous avons aussi révélé la constitution en acides aminés de tripeptides et démontré par la même occasion le manque de précision de certaines techniques. A la vue des résultats, nous vous proposons d’une part la méthode que nous avons utilisée, et d’autre part les parties de l’expérience pouvant être amélioré ainsi que quelques idées afin d’y parvenir.

Introduction:

Nous avons décidé d’étudier le lait de vache. Celui contient un grand nombre de protéines. Celle à laquelle nous nous intéressons lors de cette expérience est la caséine, qui représente 80% des protéines contenues dans le lait. Nous savons que la caséine à une forte teneur en acide glutamique, proline, leucine, lysine, sérine et thréonine. Chaque caséine contient aussi trois tyrosines dans sa séquence en acides aminés. Ce sont des protéines que nous connaissons assez bien. Malgré d’importante différence entre la caséine bovine et la caséine humaine, l’étude de la première peut nous aider à mieux comprendre la seconde. La caséine a aussi beaucoup d’importance en nutrition et peut servir de complément alimentaire, en particulier lors de la musculation.

Notre expérience va permettre l’extraction des caséines en les faisant précipiter par baisse du pH jusqu’aux alentours du point isoélectrique (ou pHi). Le culot de caséine ainsi formé n’aura donc plus que besoin d’être lavé pour obtenir de la caséine suffisamment pure pour nous intéresser. Nous allons ensuite vérifier l’efficacité de cette extraction en la comparant à la valeur théorique de caséine, que l’on obtient en comparant l’absorbance de tyrosine libre d’un hydrolysat de caséine à celle obtenue avec une gamme d’étalonnage de différente solution dont on connaît la concentration en tyrosine. Enfin nous développerons une expérience de chromatographie sur couche mince permettant de déterminer les acides aminés constitutifs d’une protéine en prenant l’exemple de tripeptides, c’est-à-dire de molécules composées de trois acides aminés.

A quel point nos méthodes d’extraction des caséines et nos techniques de révélation de la composition de la séquence en acides aminés d’une protéine sont-elles exactes ? Pourrait-on trouver d’autres méthodes plus précises ou bien améliorer celles-ci ?

Matériel et méthode :

I) Précipitation des caséines

Tout d’abord, 20 mL de lait écrémé sont prélevés auxquels 5 mL d’acide acétique (0.2 mol/L) sont ajoutés. Le mélange est laissé au repos environ cinq minute puis centrifugés dix minutes à 10°C à 4000 tours minute. Le surnageant est ensuite éliminé et le tube égoutté pendant environ cinq minutes. A cela, 10 mL d’éthanol 70% sont ajoutés et le tout centrifugé quatre minutes à 4000 tours minute. Le surnageant est de nouveau enlevé et le tube laissé à égoutter. La dernière manipulation est refaite mais avec 10 mL d’éthanol à 95% et le mélange est cette fois centrifugé cinq minutes. Après que le tube est fini d’égoutter, le précipité est récupéré est laissé sécher jusqu’au lendemain. Le culot est ensuite pesé et le rendement calculé.

La précipitation se fait car la solution est amenée à son pHi (pH auquel la charge globale des molécules est nulle et auquel les molécules ne se repoussent donc plus et peuvent d’agréger).

II) Détermination de la concentration en caséine dans une solution

La mesure se fait par la mesure de la tyrosine au sein du lait (tyrosine qui constitue un composant majeur de la caséine). La mesure se fait par absorbance grâce à une gamme d’étalonnage allant d’une concentration de 0 à 50 mg/L de tyrosine. Le volume final doit être de 1 mL) Pour réaliser cette gamme, il faut tout d’abord que les solutions de tyrosine et de HCl à concentration 0.2 mol/L soient pipetées dans des proportions correspondantes aux valeurs de la gamme d’étalonnage que l’on doit obtenir. Il faut ensuite préparé l’hydrolysat. La solution mère d’hydrolysat doit être diluée au demi dans une solution de HCl de concentration 0.2 mol/L pour un volume de 2 mL. Une solution témoin doit aussi être préparée mais en utilisant 2 mL de l’hydrolysat pur. La dilution de la solution mère est nécessaire car les concentrations doivent rester dans des proportions comparables à celles de la tyrosine mesurées précédemment. Pour réalisé la mesure de l’absorbance, 500 µl de chaque solution sont prélevés, 2.5 mL  de NaOH à concentration 0.2 mol/L et 0.25 mL de réactif de Folin y dont ajoutés. Le tout est vortexé. Enfin les absorbances sont lus à 750 nm après avoir attendu cinq à dix minutes. Les résultats sont ensuite notés et une courbe d’étalonnage tracée (valeur d’absorbance des solutions de la gamme d’étalonnage en fonction de la concentration en tyrosine pure). La mesure de l’hydrolysat diluée est ensuite placée sur la courbe et, de cette mesure, la concentration massique en tyrosine est déduite. De cette concentration, la concentration molaire en tyrosine puis la concentration molaire en caséine et enfin sa concentration massique sont déduites. De là, la masse de caséine peut-être calculée.

III) Séparation, par chromatographie de partage, d’acides aminés provenant d’hydrolysat de caséine

La chromatographie repose sur un principe selon lequel lorsqu’un produit et mis en contact avec deux solvants non miscibles, celui-ci va se répartir selon sa solubilité. Pour cette chromatographie, la phase polaire (hydrophile) est la phase stationnaire et la phase apolaire (hydrophobe) est la phase mobile. La phase stationnaire (ou film) est composé d’une feuille de cellulose et la phase mobile par un solvant constitué d’eau (1/6), d’acide acétique (1/6) et de butanol (4/6) et dont l’hydrophobicité vient du butanol (composant majoritaire du solvant). Une ligne de dépôt est tracée très légèrement avec un crayon à 2 cm d’un bord de la feuille puis un repère tous les 1 cm est placé sur cette même ligne. Les acides aminées connus sont placés entre les graduation (une seule goutte de 2 à 5µl pour un diamètre de 1 à 3 mm), un espace pour un acide aminé. Puis les tripeptides à analyser sont placé à leur tour. Le dispositif est ensuite placé dans une cuve contenant le solvant de façon à ce que seul le bord de la feuille où se trouve les acides aminés rentre en contact avec le solvant, le tout étant placé sous une hotte. Quand la phase mobile atteint les trois quart de la feuille, le chromatogramme est retiré de la cuve, le front du solvant souligné délicatement au crayon et le film séché à l’air libre sous la hotte. Une fois le film sec, une solution de ninhydrine à 0.2% dans un mélange d’éthanol et d’acide acétique (4 volume de l’un pour 1 volume de l’autre) est pulvérisée sur celui-ci. Le film est enduite séché pendant deux à trois minutes dans une étuve à 80°C. Enfin les taches laissées par les acides aminés sont comparées à celles laissées par les tripeptides nous donnant la composition de ceux-ci. La comparaison se fait par le front de migration, autrement dit la comparaison de la distance parcourue par les acides aminés sur celle parcourue par le solvant.

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