Étude cinétique de la trypsine

Compte Rendu

Étude cinétique de la trypsine

BUT

Le but de ce TP est d’étudier les caractéristiques cinétiques d’une enzyme digestive des protéines : la trypsine. Pour cela nous allons déterminer la valeur de la vitesse maximale (Vm), de la constante de Michaelis (Km) ainsi que de la constante catalytique (Kcat).

PRINCIPE

Une enzyme est une macromolécule s’agit généralement de protéine. Elle est un catalyseur spécifique pour une réaction qui se combine au substrat afin de le transformer en produit. Elle permet d’accélérer la vitesse d’une réaction sans modifier son bilan thermochimique et peut être régénérée à la fin de réaction.

L’hydrolyse enzymatique des protéines équivaut à la coupure des liaisons peptidiques entre les différents acides aminés qui les constituent.

Formule d’hydrolyse : 1

La trypsine est une endoprotéase qui contribue à la digestion des protéines alimentaires dans le pancréas en catalysant l’hydrolyse des liaisons peptidiques de 2 acides aminés basiques : la lysine et l’arginine. La catalyse par le biais de la trypsine permet d’abaisser l’énergie d’activation d’une réaction donnée. Dans cette expérience, l’hydrolyse d’une liaison peptidique dans le chlorhydrate de benzyloxycarbonylarginyl-para-nitroanilide qui nous donne une molécule de p-nitroaniline de couleur jaune, celui-ci peut être dosé spectrophotométriquement à 420 nm. D’après le spectre d’absorption, le pic d’absorbance du produit est à 380 nm. Cependant à 420 nm seul l’absorbance du produit est mesurée car le substrat n’absorbe plus.

Formule d’hydrolyse : 2

La spectrophotométrie est une méthode quantitative qui consiste à mesurer l’absorbance de la solution afin de connaître sa concentration. L’absorbance reflète la capacité à absorber la lumière d’une certaine longueur d’onde et cette valeur est directement liée à la concentration selon la loi de Beer-Lambert :

A = 𝓔.L.c

avec :

𝓔 : le coefficient d'absorption molaire en L.mol⁻¹.cm⁻¹

L : la longueur du chemin optique traversé par la lumière dans la solution en cm

c : la concentration molaire de l’espèce chimique dosée en mol.L⁻¹

Formule 3

Nous pouvons mesurer l’absorbance au cours du temps et à partir des résultats nous pourrons connaître l’activité enzymatique de la trypsine grâce à l’équation de Michaelis-Menten :

Vi = (Vm×[S]) / (Km+[S])

avec :

Vi : la vitesse initiale (la vitesse de transformation d'un substrat par une enzyme au temps t ≃ 0)

Vm : la vitesse maximale théorique (la vitesse de transformation d'un substrat par une enzyme en présence d'une concentration saturante de substrat)

Km : la constante de Michaelis (la valeur de la concentration de substrat pour laquelle la vitesse de réaction enzymatique est égale à la moitié de la vitesse maximale, elle est un reflet de l'affinité du substrat par l’enzyme, plus Km est petite, plus l'affinité est forte.)

[S] : la concentration molaire du substrat

Kcat : la constante catalytique ou turnover (c’est le nombre de molécules de substrat transformées par unité du temps par chaque site actif, sa unité est inverse du temps)

RÉSULTAT

Préparer 50 mL de solution de Z-Arg-p-NA 2 mmol.L-1 à partir de la solution mère 200 mmol.L-1 :

Ci.Vi = Cf.Vf

Vi = 0,5 ml : nous utilisons 0,5 ml de la solution mère

Étude de vitesse de la réaction au cours du temps :

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