Trypsine

Définition :

Enzyme : Une enzyme est une protéine, qui est spécifique à une réaction. Elle permet d’accélérer la vitesse d’une réaction sans modifier son bilan thermochimique, de plus elle peut être régénérée en fin de réaction ou se combiner à un substrat pour le transformer en produit.

Vitesse : Elle représente le nombre de moles de substrat transformées en produit, dans un volume donné et dans un temps donné. Elle est exprimée en micromol/min.

Vitesse initiale : la vitesse ou la concentration en substrat est stationnaire. Elle est constante et maximale.

Vm : Il s’agit de la vitesse maximale théorique que pourrait atteindre l’enzyme si elle était totalement saturée par son substrat.

KM : Il s’agit de la constante de Michaelis qui permet de mesurer l’affinité de l’enzyme pour le substrat, si KM est élevé alors l’affinité est faible et inversement.

Kcat : iI s’agit du nombre de molécules de substrat transformé en produit par temps et par molécule d’enzyme, quand l’enzyme est saturée.

Choix de la longueur d’onde à 410nm.

On voit que le pic d’absorbance du produit est à 380 nm. Cependant, nous voulons doser le produit, alors qu’à cette longueur d’onde, le substrat absorbe toujours. Mais, le substrat commence à ne plus absorber à une longueur d’onde de 410 nm alors que le produit absorbe toujours à cette absorbance données. Donc , c’est pour cela que l’on a choisi 410nm où le produit libéré par la réaction enzymatique va être dosé par spectrophotométrie.

La trypsin est une protéase digestive du suc pancréatique qui a pour but de digérer les protéines alimentaires. C’est une endoprotéase qui permet l’hydrolyse des liaisons peptidiques dans lesquelles un acide aminé basique, la lysine ou l’Argentine engagé sa partie -CO-.

Nous pouvons étudier son activité enzymatique et son mécanisme d’action à l’aide d’un substrat synthétique: le chlorhydrate de benzyloxycarbonylarginyl-para-nitroanilide (Z-Arg-p-NA,HCL)

L’hydrolyse de ce substrat synthétique par la trypsin libère la p-nitroaniline. Ce produit peut être dosé par spectrophotométrie à 420 nm. Nous nous rendrons compte de l’activité enzymatique de la trypsine avec l’augmentation de l’absorbance au cours du temps. A partir des résultats obtenues nous pourrons déduire ces paramètres cinétique (KM,VM et v) grâce à l’équation de Michaelis-Menten

v= VM*S /KM+S

Dosage par spectrophotométries:

Le principe est de mesurer à l’aide le spectrophotomètre l’absorbance une solution pour une longueur d’onde donnée. Cette mesure est directement proportionnelle à la concentration du produit étudié. Or la concentration de ce produit est le résultat d’une activité enzymatique plus ou moins intense de la trypsine, donc une production plus ou moins significative de la p-nitroaniline. La concentration en p-nitroaniline peut alors être déduite de l’absorbance par la loi de Beer Lambert. Dans notre cas les spectrophotomètre est relié à un ordinateur qui va

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