Trypsine

1. BUT  

L’objectif de ce TP est de déterminer expérimentalement les caractéristiques cinétiques de la trypsine, une enzyme protéolytique du suc pancréatique qui brise les liaisons peptidiques des protéines. Il s’agira donc, en utilisant la spectrophotométrie, de déterminer dans un premier temps la vitesse de la réaction d’hydrolyse au cours du temps, puis l’influence de la concentration en trypsine et en substrat, afin de déterminer la valeur de la vitesse maximale (Vm), la constante de Michaelis (KM) et la constante catalytique (kcat).

1. PRINCIPE 

1) Réaction d’hydrolyse du substrat par la trypsine 

L’hydrolyse enzymatique consiste en une réaction chimique qui est catalysée par des hydrolases en milieu aqueux et qui aboutit à la scission d'un composé.

La trypsine, enzyme digestive du suc pancréatique, a pour but de digérer les protéines. C’est une endoprotéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide aminé basique, la lysine ou l’arginine, engage sa fonction acide. Ici, la trypsine permet de catalyser l’hydrolyse du substrat (Z­Arg­p­NA) qui libère du p­nitroaniline dans les mêmes proportions, un chromophore de couleur jaune.

(+ Réaction d’hydrolyse du substrat par la trypsine : R1-COOH + NH-R2-NO2)

2) Spectrophotométrie

a. Principe

Ceci nous permet de mesurer son absorbance en fonction du temps grâce à la spectrophotométrie, pour ainsi en déduire la concentration du substrat au cours du temps sachant que l’absorbance est proportionnelle à la concentration selon la loi de Beer-Lambert :

A= l.c.ε

Avec :

• A : absorbance (sans unité)
• l : trajet optique (cm)
• c : concentration du substrat dans la solution (mol.L-1)
• ε : coefficient d’absorption moléculaire (L.M­1.cm­1)

L’absorbance au cours du temps va augmenter car nous suivons la vitesse d’apparition du produit. A partir de ces résultats nous pourrons déterminer l’activité enzymatique de la trypsine et en déduire ses paramètres cinétiques grâce à l’équation de Michaelis­Menten :

[pic 1]

Avec : v = vitesse initiale, Vm = vitesse maximale et KM = constante de Michaelis 

b. Choix de la longueur d’onde à 410nm

Nous constatons sur le spectre d’absorbance présent dans le fascicule, que le pic d’absorbance du produit que l’on veut doser se situe à 380nm. Or à cette longueur d’onde, le substrat absorbe toujours. Nous constatons alors qu’à une longueur d’onde de 410nm le substrat n’absorbe plus tandis que le produit absorbe toujours suffisamment. C’est pourquoi la longueur d’onde de 410 nm est retenue pour le dosage par spectrophotométrie du produit libéré (la p­nitroaniline) après l’hydrolyse enzymatique.

3) Définitions

• Enzyme : une enzyme est une protéine, elle est spécifique d’une réaction. Elle permet de catalyser cette réaction sans modifier son bilan thermochimique et en fin de réaction elle peut être régénérer (enzyme libre) ou se combiner à un substrat afin de le transformer en produit.
• Vitesse : la vitesse de réaction représente le nombre de moles de substrat transformées en moles de produits, dans un volume donné et dans un temps donné : elle est donc exprimée en μmol/min
• Vitesse initiale : la vitesse initiale correspond au stade de la réaction où la concentration en substrat n’a pas changée (période stationnaire). Elle est constante et maximale.
• Vm : Vm est la vitesse initiale maximale théorique que pourrait atteindre l’enzyme si elle était totalement saturée par son substrat.
• KM : KM est appelée « constante de Michaelis » et permet de mesurer l’affinité de l’enzyme pour le substrat, si KM est élevé alors l’affinité est faible et inversement.
• kcat (ou turnover) : il s’agit du nombre de molécules de substrat converties en produit par temps par chaque site actif, quand l’enzyme est saturé ; kcat représente donc l’efficacité catalytique de l’enzyme.

1. RESULTATS

1) Etude de vitesse de la réaction au cours du temps (programme Trypsine A)

• Calcul du coefficient d’absorbance

[Z­Arg­p­NA]= [p­NA]= 98μmol/L ; A410nm= 0,868 ; l = 1cm

Il s’agit de calculer le coefficient d’absorbance ε à partir de ces donnés spectrales.

Or, d’après la loi de Beer-Lambert : A= l.c.ε   

D’où ε = A / (c.l)

Ainsi ε = 0,868 / ((98×10­6) × 1)  = 8857,14 L.M­1.cm­1 

• Calcul du volume final

Le volume final du milieu réactionnel en présence d’enzyme :

vfinal= (vsubstrat + venzyme + vtampon)

Ainsi on a vfinal = (0,020+1,980) ×10­3 + 25×10­6= 2,025×10­3 L

• Conversion des vitesses ∆A/min en nmol pNA/min

On en déduit la vitesse en nmol p­NA/min = (vitesse∆A/min-1⁡×Vfinal)/ε

Donc, par exemple, si on calcul la vitesse à t=4min, on a :

v = ((0,0072 ⁡× (2,025×10­3)) / (8857,14)) ×10­9 = 1,65 nmol p­NA/min

TABLEAU 1 : résultats des vitesses initiales en ∆A/min, converties en nmol pNA/min

2) Etude de l’influence de la concentration d’enzyme (programme Trypsine B)

...