TP trypsine

Etude cinétique de la trypsine

I. But

Le but de ce TP est de déterminer les paramètres cinétiques de la trypsine :

* Le KM qui correspond à la constante de Michaelis ;

* La Vmax qui correspond à la vitesse maximale et ;

* v, la vitesse initiale.

II. Principe

La trypsine est une enzyme digestive du suc pancréatique qui a pour but de digérer les protéines. La trypsine est une endoprotéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide aminé basique, la lysine ou l’arginine engage sa fonction acide. Elle coupe en C-terminal de ces acides aminés.

Nous pouvons étudier ces paramètres cinétiques à partir d’un substrat synthétique : le chlorhydrate de benzyloxycarbonylarginyl-para-nitroanilide (Z-Arg-p-NA, HCL).

L’hydrolyse de ce substrat par la trypsine libère un produit chromophore la p-nitroaniline. Celui-ci peut être dosé spectrophotométriquement à 420 nm.

Grace à cette propriété, nous allons pouvoir mesurer la variation de l’absorbance en fonction du temps. L’absorbance au cours du temps va augmenter ca nous suivons la vitesse d’apparition du produit. A partir des résultats nous pourrons connaître l’activité enzymatique de la trypsine et en déduire ces paramètres cinétiques (KM , Vm et v) grâce à l’équation de Michaelis-Menten :

v = Vm × SKM + S

v=vitesse initiales

Vm =vitesse

maximale

KM =constante de Michaelis

III. Résultats et interprétation

1. Réaction d’hydrolyse du substrat par la trypsine

2. Choix de la longueur d’onde

Le pic d’absorbance du produit est à 380nm. Cependant, à cette longueur d’onde le substrat absorbe toujours, alors que nous désirons doser spectrophotométriquement que le produit.

A partir de 410nm, le substrat n’absorbe plus tandis que le produit absorbe toujours suffisamment.

C’est pour cela que l’on choisit λ = 410nm.

3. Définitions

* Une enzyme est un biocatalyseur, agissant à des concentrations très faibles, capable de multiplier la vitesse de réaction par des facteurs très élevés sans en modifier le résultat. Une enzyme donnée est spécifique d’une réaction (elle catalyse toujours la même transformation). Elle est plus efficace qu’un catalyseur chimique.

* La vitesse initiale de réaction est la variation de concentration par unité de temps en déséquilibre totale. Elle s’exprime en M.tps-1. Les mesures de vitesse se réalisent en général en cinétique initiale pour éviter l’inhibition par les produits ou une inactivation de l’enzyme au cours du temps.

* La vitesse maximale Vm est la vitesse initiale que peut atteindre la réaction lorsque l’enzyme est saturée en substrat, c’est à dire lorsque [E]T = [ES]. Ce n’est pas une

constante intrinsèque.

* La constante de Michaëlis KM est la concentration en substrat pour laquelle. C’est une constante intrinsèque qui permet de mesurer l’affinité de l’enzyme pour son substrat. La valeur du KM dépend du pH, de la température et éventuellement du tampon, mais elle n’est pas fonction de la concentration en enzyme.

* La constante catalytique kcat (ou turnover) est le nombre de moles de substrats transformées par moles d’enzyme par unité de temps. Elle s’exprime en tps-1. Elle représente donc le nombre de cycles catalytiques par seconde dont est capable l’enzyme.

4. Etude de l’influence de la concentration d’enzyme

Essai | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |

Z-Arg-p-NA 2 mmol.L-1 mL | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |

Solution d’enzyme μL | 0 | 20 | 30 | 40 | 50 |

Concentration en enzyme μmol.L-1 | 0 | 0.42 | 0.63 | 0.84 | 1.04 |

Vitesse initiale de réaction lue ΔA.min-1 | 0.004 | 0.0594 | 0.0912 | 0.1059 | 0.1332 |

Vitesse initiale de réaction réelle ΔA.min-1 | 0 | 0.0554 | 0.0872 | 0.1019 | 0.1292 |

Calcul de la concentration totale en enzyme :

Exemple de calcul pour les concentrations

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