TP : Etude cinetique de la trypsine

TP : ETUDE CINETIQUE DE LA TRYPSINE

BUT :

Nous allons dans ce TP étudier les caractéristiques cinétiques d’une enzyme digestive des protéines, la trypsine. Pour cela, nous allons déterminer la valeur de Vm, de KM ainsi que du kcat.

PRINCIPE :

L’hydrolyse du substrat par la trypsine :

L’hydrolyse enzymatique : Réaction chimique, catalysée par des enzymes du type hydrolase, au cours de laquelle intervient obligatoirement une molécule d'eau et qui aboutit à la scission d'un composé.

La trypsine est une enzyme digestive du suc pancréatique qui a pour but de digérer les protéines. La trypsine est une endoprotéase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide aminé basique la lysine ou l’arginine engage sa fonction acide. Dans cette expérience la trypsine va catalyser l’hydrolyse du substrat (Z-Arg-p-NA) qui se transforme en p-nitroaniline, un produit coloré jaune. Nous allons ensuite mesurer son absorbance en fonction du temps grâce à la spectrophotométrie. L’absorbance au cours du temps va augmenter car nous suivons la vitesse d’apparition du produit. A partir des résultats nous pourrons connaître l’activité enzymatique de la trypsine et en déduire ces paramètres cinétiques grâce à l’équation de Michaelis-Menten : v=(Vm×[S])/(KM+[S])

Réaction d’hydrolyse du substrat par la trypsine

La spectrophotométrie :

Choix de la longueur d’onde à 410nm

Nous constatons sur le spectre d’absorbance, que le pic d’absorbance du produit est à 380nm. Or nous voulons doser le produit, alors qu’à cette longueur d’onde, le substrat absorbe toujours. De plus, nous constatons que le substrat n’absorbe plus à une longueur d’onde de 410nm plus tandis que le produit absorbe toujours suffisamment. C’est pourquoi, nous choisissons la longueur d’onde à 410 nm ou le produit libéré (la p-nitroaniline) après la réaction enzymatique va pouvoir être dosé par spectrophotométrie.

Les définitions :

Enzyme : Une enzyme est une protéine, elle va être spécifique à une réaction. Elle permet d’accélérer la vitesse d’une réaction sans modifier son bilan thermochimique et en fin de réaction elle peut être régénérer (enzyme libre) ou se combiner à un substrat afin de le transformer en produit.

Vitesse : la vitesse de réaction représente le nombre de moles de substrat transformées en moles de produits, dans un volume donné et dans un temps donné : ainsi elle est exprimée en µmol/min

Vitesse initiale : la vitesse ou la concentration en substrat n’a pas changée (période stationnaire). Elle est constante et maximale.

V_m : la vitesse initiale maximale théorique que pourrait atteindre l’enzyme si elle était totalement saturée par son substrat.

KM : Il s’agit de la constante de Michaelis qui permet de mesurer l’affinité de l’enzyme pour le substrat, si KM est élevé alors l’affinité est faible et inversement.

kcat : ou le nombre de rotation, il s’agit du nombre de molécules de substrat converties en produit par temps par chaque site actif, quand l’enzyme est saturé.

RESULTATS :

Etude de vitesse de la réaction au cours du temps (programme Trypsine A)

Conversion des vitesses ∆A/min en nmol pNA/min :

Les données spectrales sont :

[Z-Arg-p-NA]= [p-NA]= 98µmol/L ; A410nm= 0,848 ; l= 1cm

Nous allons calculer le coefficient d’absorbance ε à partir de ces donnés spectrales et du volume final (volume du milieu réactionnel en présence d’enzyme)

Or A= l × c×ε avec c= [Z-Arg-p-NA]= [p-NA]=98µmol/L

D’où ε= A/(c ×l)

Ainsi ε = 0,848/((98×〖10〗^(-6) )×1)

= 8653,06 1M-1.cm-1

Le volume final du milieu réactionnel en présence d’enzyme = vfinal= (vsubstrat + venzyme +vtampon)

Ainsi vfinal = (0,020+1,980) ×10-3 + 25×10-6= 2,025×10-3 L

D’où la vitesse en nmol p-NA/min = (vitesse(∆A/min⁡〖-1〗 )×Vfinal)/ε

Nous prenons comme exemple, la vitesse à t=2

Ainsi v= (0,0828×(2,025×〖10〗^(-3)))/8653,061= 1,938 ×10-9 mol/min

= 19,38 nmol p-NA/min

Temps

(min) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

v

(A/min) 0,15 0,1260 0,0828 0,0648 0,0372 0,0240 0,0192 0,0126 0,006 0,0058 0,0012

v (nmol p- NA/min) 35,103 29,487 19,38 15,164 8,705 5,616 4,493 2,949 1,404

1,357 0,281

Tableau n°1 résultats des vitesses en ∆A/min, converties en nmol pNA/min

Etude de l’influence de la concentration d’enzyme (programme Trypsine B)

Conversion des vitesses ∆A/min en nmol pNA/min :

Le volume final du milieu réactionnel en présence d’enzyme = vfinal = (vsubstrat + venzyme)

Nous prenons comme exemple, venzyme pour 20µL

Ainsi vfinal = 2×10-3 + 20×10-6= 2,02×10-3 L

Pour les volumes d’enzymes de 20 µL ,30 µL, 40 µL, 50 µL, le ε vaut toujours 8653,061 M-1.cm-1

D’où la vitesse en nmol p-NA/min = (vitesse(A/min⁡〖-1〗 )×Vtotal)/ε

Nous prenons comme exemple de calcul de vitesse, la vitesse du venzyme= 20µL

Ainsi v= (1,1605×(2,02×〖10〗^(-3)))/8653,061 = 2,7091× 10^-7 mol/min

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