TP - Etude de la chaine respiratoire.

TP Etude de la chaîne respiratoire

1)But

L’objectif de ce TP, est d’étudier le fonctionnement de la chaîne respiratoire. Pour cela, on va isoler les mitochondries du foie de rat, et mesurer à l’aide d’un oxygraphe, l’évolution de la concentration en oxygène en fonction du temps (une cinétique) et analyser les effets des différents inhibiteurs de cette chaîne respiratoire.

2)Principe

Oxygraphie: L'oxygène diffuse à travers la membrane de l’électrode. Au niveau de la cathode, il est réduit ce qui génère un courant électrique proportionnel à la vitesse à laquelle diffuse l’oxygène à travers cette membrane, donc à la concentration en dioxygène dissout et par conséquent à sa consommation dans le milieu. L’oxygène étant l’accepteur final d’électrons dans la chaîne respiratoire, cette méthode nous permettra de suivre la consommation en oxygène dans la mitochondrie.

Chaine respiratoire (voir schéma annexe 1): La chaine respiratoire correspond à une association de différents complexes protéiques présent au sein de la membrane interne de la mitochondrie. Elle est responsable, avec l’ATP synthétase, de la phosphorylation oxydative. Son fonctionnement associe l’oxydation, respectivement, du NADH puis du FADH2 (tous deux produits lors de glycolyse et cycle de Krebs), dans le but de produire de l’ATP et ceci grâce à la formation d’un gradient de protons.

La chaîne respiratoire est composé de 4 complexes, d’une ATP synthétase et de deux transporteurs.

3)Analyses et résultats

- Tampon de respiration : Ce tampon apporte l’oxygène nécessaire aux mitochondries pour rétablir in vitro les conditions physiologique. Ainsi on étudie dans de bonnes conditions le fonctionnement de la chaîne respiratoire. On vérifie que la ligne de base est stable.

- Suspension de mitochondries : Les mitochondries purifiées sont ajoutées au milieu. La respiration cellulaire se déroule dans ces organites. Une pente non négligeable de courte durée est observable dans les différents tracés.

Tracé 1 :

- Après incorporation des mitochondries, on observe une pente faible et positive, qui reflète une légère consommation d’oxygène. On peut dire que la chaine respiratoire fonctionne avec le NADH du complexe I apporté depuis le Cycle de Krebs ou bien que d’autres réactions mitochondriales se produisent en consommant de l’oxygène. Nous sommes ici en présence d’une respiration endogène.

- Après incorporation du succinate, on observe une diminution de la quantité d’oxygène et donc une augmentation de la consommation d’oxygène : l’état IV est atteint. Le succinate est directement apporté au complexe II, qui l’oxyde en fumarate et cède ses 2 électrons à l’ubiquinone. L’ajout de ce composé active encore plus ce complexe (donc la chaine respiratoire) d’où l’augmentation de la consommation d’oxygène.

- En ajoutant ensuite de l’ADP, on constate que la consommation d’oxygène est encore plus importante (pente plus importante). L’état III est atteint. Or on sait que l’ADP est le substrat de l’ATP synthase. Le gradient d’H+ est faible (les protons retournent dans la matrice mitochondriale pour former l’ATP). Le transfert d’électrons est alors accéléré et donc la consommation d’oxygène augmente. Il y a donc couplage entre la synthèse d’ATP (donc consommation d’ADP), le gradient et le transfert d’électrons (consommation d’O2 directement proportionnelle au transfert d’électrons dans la chaine respiratoire). On en conclut que la chaine respiratoire fonctionne d’avantage (oxygène d’avantage consommé) pour reconstituer le gradient de protons qui est dissipé par l’ATP synthase lorsqu’elle synthétise l’ATP.

L’apparition d’une nouvelle pente, plus basse, qui correspond à celle de l’état IV précédent, nous indique un état IV de retour. C’est-à-dire que la totalité de l’ADP a été transformée en ATP lors de la phosphorylation oxydative.

Remarque : Une seconde injection d’ADP est effectuée afin de comparer les vitesses de consommation de l’ADP à l’état III et IV, ce qui nous permettra de calculer le RCR.

- La seconde injection d’ADP montre le même effet observé après la première addition d’ADP : il y a apparition d’un état III puis d’un état IV de retour.

Remarque : Les différents ajouts d’ADP permettent d’augmenter la consommation d’O2 par une hausse du transfert d’électrons. Il y a donc stimulation de la chaine respiratoire.

Tracé 2 :

Remarque : Glutamate-Malate : Dans le Cycle de Krebs, le Malate en présence de NAD+ donne de l’oxaloacétate et du NADH + H+. Cependant le Malate peut également donner du Fumarate. On veut former du NADH + H+ afin de transporter les électrons pour la chaine respiratoire au niveau du complexe I. Pour cela, on va donc forcer la réaction de formation d’oxaloacétate. Afin d’y parvenir, on rajoute du Glutamate dans notre milieu. En présence d’oxaloacétate, le Glutamate va donc réagir avec celui-ci et donner par réaction de transamination de l’α-cétoglutarate et de l’aspartate. Cette réaction va donc nous permettre de favoriser la production d’oxaloacétate et donc de NADH + H+.

- Comme précédemment, l’ajout de mitochondries met en évidence la légère consommation d’O2 correspondante au fonctionnement de la chaine respiratoire.

- Lors de l’ajout de Glutamate-Malate, la pente augmente. On observe donc une augmentation de la consommation d’oxygène (plus importante que le succinate). En effet, le Glutamate-Malate est le substrat donneur d’électrons au niveau du complexe I, où le NADH s’oxyde en NAD+. Les électrons sont alors transloqués directement au complexe III sans passer par le complexe II, puis au complexe IV pour réduire l’oxygène. On introduit ensuite l’ADP (toujours 2 injections) et on constate les mêmes effets que l’expérience 1.

L’oxygramme 1 et 2 démontrent le couplage respiratoire dans les mitochondries, soit le fonctionnement de la chaine respiratoire/ATP synthase. Autrement dit, il montre le couplage gradient de protons/flux d’électrons/consommation d’oxygène.

Tracé 2 bis

L’ajout

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