Étude du fonctionnement de la chaîne respiratoire

BUT

Le but de ce TP est d'étudier le fonctionnement de la chaîne respiratoire de mitochondries. Le foie étant un tissu particulièrement riche en mitochondrie, nous l'utiliserons pour cette étude. Pour comprendre le fonctionnement de la chaîne respiratoire, nous utiliserons un oxygraphe pour suivre l'évolution de la concentration en oxygène au cours du temps.

La chaîne respiratoire est localisée dans la membrane interne mitochondriale. Cette chaîne de transport d'électrons est constituée de quatre complexes enzymatiques :

• complexe I : NADH déshydrogénase

• complexe II : succinate déshydrogénase

• complexe III : cytochrome b-c1

• complexe IV : cytochrome c oxydase

La chaîne respiratoire permet de réoxyder les coenzymes NADH et Ubiquinone réduits au cours du cycle de Krebbs. Cette réoxydation s'accompagne de la création d'un gradient transmembranaire de protons qui va servir à fabriquer de l'ATP, molécule énergétique universelle.

Lors du transfert des électrons de l'ensemble de la chaîne de transport d'électrons, on concidère que:

• Le premier donneur de protons et d'électrons (NADH + H+)

• Le dernier accepteur d'électrons (l'oxygène moléculaire, O2 pour former 1mole d’H2O)

Matériel et méthodes

• Préparation de la suspension mitochondriale:

Dans ce TP, on utilise des mitochondries fraîches extraites à partir d'un foie de rat.

Après une série de centrifugation, on récupère le culot qu'on suspend dans un tampon.

Manipulations

Pour ces expériences, on utilise un oxygraphe. Il s'agit d'un appareil de mesure qui utilise une électrode à dioxygène constituée par une cathode et une anode reliée par une solution conductrice. L'ensemble est séparé du milieu par une membrane imperméable à l'eau et aux ions mais perméable au dioxygène dissout, l’ensemble sera appelé « Cellule ». L'électrode est polarisée. On enregistre le courant électrique généré grace à un enregistreur régle à 1V/division et sur 1cm/min. L'intensité du courant est proportionnelle à la quantité d'oxygène dissoute dans le milieu. On peut ainsi suivre la consommation d'oxygène qui est l'accepteur final de la chaîne respiratoire. Grâce aux tracés obtenus nous pourrons calculer la pente et donc en déduire le RCR (Rapport de contrôle respiratoire) qui est le rapport entre la pente mesurée après addition d'ADP et lapente mesurée après l'épuisement de l'ADP ainsi que le l' ADP/O (rapport du nombre de mole ADP ajoutés sur le nombre de mole d'atomes d'oxygène consommé pendant la stimulation de la respiration,

Protocole :

-Dans un premier temps, à partir de substrats indirects de la chaine respiratoire, il s’agit de déterminer les caractéristiques du couplage entre la chaine respiratoire et la phosphorylation (Tracé1 et Tracé2)

-Dans un second temps, il s’agit d’identifier le lieu d’action de 4 effecteurs (Tracé3, Tracé4 et Tracé5)

Tracé 1:

Pour réaliser le tracé 1, nous plaçons dans la cellule 1,5 mL de tampon de respiration, 10 µL de la suspension de mitochondries. Nous fermons la cellule ou chambre de mesure par un piston doté d’un fin canal, par le quel nous ajoutons 10µL de succinate à 1M. C’est par ce même canal que nous ajouterons 8 µL d’ADP; quand la courbe reprend l’allure d’avant l’ajout d’ADP, nous injectons de nouveau 8µL d’ADP dans la chambre de mesure.

Interpretation des résultats:

*Ajout du tampon de respiration: l’enregistreur trace une droite verticale.

*Ajout des mitochondries: on observe une pente non négligeable de courte durée. Cette consommation transitoire d’O2

→ alors que le Succinate n’est pas encore ajouté) est liée aux substrats endogènes contenues dans les mitochnondries elles-mêmes: NADH et FADH, leurs quantité étant très faible, la consommation d’O2 ne dure pas longtemps.

*Ajout de Succinate: nous observons une accélération de la consommation d’O2, la courbe a une pente significative.

*Ajout d’ADP (n°1): la pente est importante, la consommation d’oxygène est accélérée, puis va se stabiliser.

*Ajout d’ADP (n°2): la consomation de l’O2 augmente, puis la vitesse se stabilise.

[Nos courbes étant inexploitable, Voici ce que nous aurions dût observé]

Tracé 2:

Pour le tracé 2, nous mettrons 1,5 mL de tampon de respiration et 15 µL de suspension de mitochondries.

Après fermeture de la chambre, nous injecterons 10µL d’un mélange Glutamate-Malate. Nous ajouterons 10 µl d’ADP après que la vitesse soit redevenue identique à celle d’avant ajout d’ADP, nous injecterons enfin 10 µL d’ADP.

Interprétation des résultats:

*A l'ajout du tampon et des mitochondries, on a la même réaction qu'au tracé1

*Ajout du Glutamate-Malate: augmentation de la consomation d'O2

→ la réduction du Malate grace au NADH, provoque la libération de deux protons, l’un avec le malate, l’autre avec l’acide glutamique. Ces deux protons rentrant dans la mitochondrie, restituent l’énergie libre qu’ils ont acquise en étant pompés vers l’extérieur par les complexes de la chaîne respiratoire. Cette énergie qui est le moteur qui permet le fonctionnement de la navette malate/aspartate est donc couplée aux oxydations de la chaîne respiratoire mitochondriale, comme la phosphorylation de l’ADP)

*Ajout d’ADP (n°1): la consommation d’oxygène augmente.

On attend que la vitesse redevienne identique à celle avant l'ajout d'ADP

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