Synthèse purification TM1752 R198K

Purification TM 1752 R198K.

Préculture.

50 ml milieu 853 over night 37°C.

Culture (2 litres).

Milieu :

• 853 sans glucose.
• 0.05% glucose (conc finale)
• Ampicilline.

Ensemencer milieu avec 1/100 volume préculture (37°C)

D.O. ~0.6-0.8 → Induction au Rhamnose 0.1% (conc. finale).

Laisser courir la culture toute la nuit à 37°C.

Centrifuger la culture et resuspendre le culot dans 1/10 volume culture dans NaCl 0.9% et centrifuger

Conserver le culot à -20°C si nécessaire.

Extrait brut.

Resuspendre le culot dans 75 ml  de culture dans tampon :

• Hepes 25mM pH7.5
• NaCl 150mM
• EDTA free inhibitor protease.

Soniquer 20 minutes pulse (0.5/0.5).

Centrifuger 20 minutes à 12 000 tours/minute.

Récupérer la fraction soluble.

Thermodénaturation.

Thermodénaturation 5 minutes à 60°C.

Centrifuger 20 minutes à 12 000 tours/minute.

Récupérer la fraction soluble.

IMAC.

Tampon charge et lavage :

• Hepes 25mM pH7.5
• NaCl 150mM

Step quand la ligne de base est revenue à zéro :

• Hepes 25mM pH7.5
• NaCl 150mM
• Imidazole 20 mM pH 7.5 (5%).

Gradient 8 à 10 CV quand la ligne de base est revenue à zéro  (2.5 ml/min, 60 minutes):

• Hepes 25mM pH7.5
• NaCl 150mM
• Imidazole 400 mM pH 7.5 (100%).

[pic 1]

IMAC.

[pic 2][pic 3][pic 4][pic 5][pic 6]

SDS PAGE :

1. Extrait brut.
2. Extrait thermodénaturé.
3. Fraction n° du pic lavage.
4. Fraction n° du palier 20mM imidazole.
5. Et suivante : pic contenant TM 1752 R139K.

Dialyse pour éliminer NaCl et Imidazole : 3*30 minutes contre 1 litre de tampon :

• Hepes 25mM pH 7.5.

Echangeuse anionique.

Tampon lavage :

• Hepes 25mM pH 7.5.

Tampon d’élution 4 à 5 CV (2.5 ml/min, 80 min.):

• Hepes 25mM pH 7.5.
• NaCl 400mM (100%)

[pic 7]Echangeuse anionique : DEAE. 

[pic 8][pic 9][pic 10][pic 11][pic 12]

SDS PAGE :

1. Sortie IMAC.
2. et pistes suivantes : pic contenant TM 1752 R198K (tubes 55 à 72).

  Dimérisation de TM1752 R198K sur gel. Vérification Spectro masse à prévoir !!!

Dialyse 3*30 minutes contre 1 litre de tampon RT:

• Hepes 25 mM pH 7.5
• NaCl 250 mM
• Glycérol 10%

Tableau récapitulatif.

Aberration quantité protéine extrait brut et thermo.

Aberration quantité protéine DEAE.

Boite TM1752 R198K (-80°).

TM1752 R198K : 100 µl/tube

Tampon conservation :

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