Séparation de l'alanine et l'arginine

TP 1 - Séparation de l’alanine et de l’arginine sur résine échangeuses d’ions

1- But

Le but de ce TP est de séparer deux acides aminés qui sont l’argine et l’alanine et ainsi de déterminer leurs concentrations dans le mélange initial, connaissant la concentration totale d’acides aminés dans cette solution.

Nous commencerons par séparer les deux acides aminés à l’aide d’une chromatographie par échange d’ions, et nous vérifierons, à l’aide d’une réaction spécifique à un des acides aminés, que cette séparation est bien effective (dans notre cas l’arginine). Ensuite, à l’aide d’un titrage spectrophotométrique, nous déterminerons la concentration d’un des deux acides aminés (ici alanine), ce qui nous permettra, après avoir vérifié que ce dosage n’a bien concerné que le premier acide aminé, d’en déduire la concentration de l’autre.

2- Principe

Les acides aminés possèdent un groupe carboxyle (COOH) et un groupe amine (NH2). Les groupes sont liés au carbone adjacent au groupe carboxyle dans le cas des acides alpha-aminés.

En milieu basique, le groupe carboxyle se comporte comme un acide faible et libère donc un proton H+ :

En milieu acide, le groupe amine se comporte comme une base faible et capte donc un proton H+ :

Ainsi, ces propriétés acidobasiques permettent de déterminer différentes formes de l’acide aminé en fonction du pH et du pKa :

De plus, si cette acide aminé possède un groupement acide ou basique sur sa chaine latérale on obtiendra donc une forme supplémentaire qui peut être soit AA2+ soit AA2-

On peut donc dire qu’à chaque pH, on aura une forme différente prédominante. On peut donc l’écrire sous la forme suivante :

On observe donc sur le diagramme précédent une forme AA0. Cette dernière correspond à la forme où l’acide aminé est électriquement neutre (la forme zwitteriène). Le pH correspondant à cette forme s’appelle le point isoélectrique noté pHi

On peut le calculer de la manière suivante :

Le pH peut être comparé au pHi ce qui nous permet de déterminer la charge de l’acide aminé c’est à dire :

- à un pH > pHi la charge de l’acide aminé sera négative

- à un pH < pHi la charge de l’acide aminé sera positive

Cette propriété sera donc utilisé lors de la séparation des constituants de notre mélange.

Chromatographie par échanges d’ions

On va donc effectuer une chromatographie par échanges d’ions.

Cette chromatographie est une méthode de séparation qui est basée sur les différences d’affinités des substances à analyser à l’égard de deux phases, l’une fixe et l’autre mobile.

La phase mobile correspond à une solution tampon et la phase fixe est un gel sur lequel ont été greffés des groupements chimiques ioniques et accessibles.

La séparation correspond donc à l’échange du contre ion porté par la phase fixe avec les ions de même signe en solution dans la phase mobile.

Pour notre phase fixe, nous avons utilisé une résine d’Amberlite IRC 50. Cette dernière possède une groupement acide carboxylique et sera donc un échangeur de cations qui et elle permettra ainsi de retenir les acides aminés dont la charge électrique est positive. 
On obtiendra donc cette réaction suivante :

En revanche les deux acides aminés que nous utilisons dans ce TP possèdent des pHi différents. Nous devons donc procéder en deux étapes.

Lors de la première étape, nous allons utiliser une première solution tampon qui possède un pH inférieur au pHi d’un de nos deux acides aminés (la charge nette de ce dernier sera donc positive et ainsi il sera retenu sur la phase fixe) et donc un pH supérieur au pHi de notre deuxième acide aminé ce qui permettra d’éluer ce dernier car il aura une charge négative.

Lors de la deuxième étape, nous allons utiliser une seconde solution tampon qui aura un pH supérieur au pHi de l’acide aminé qui a été retenu lors de la première étape sur la phase fixe. Ainsi, cette acide aminé aura dans un deuxième temps une charge négative et sera donc élué à son tour.

Après ces étapes, on obtient nos deux acides aminés qui sont séparés et ainsi, on va pouvoir doser l’un d’entre eux et donc en déduire la concentration de l’autre acide aminé présent dans le mélange initial. Pour le dosage de l’acide aminé, on va utiliser un dosage spectrophotométrique.

Dosage spectrophotométrique

Il existe de nombreuses molécules qui sont capables d’absorber la lumière c’est le cas des substances colorées dites aussi chromophores. Ces dernières absorbent les radiations du spectre visible. Cette capacité d’absorber la lumière est caractérisée par une grandeur qui est l’absorbance notée A.

En revanche notre acide aminé n’est pas coloré donc nous allons devoir utiliser une substance colorée, qui dans notre cas, est la ninhydrine. Cette dernière réagit avec les acides aminés pour former du Pourpre de Ruhuemann qui a une couleur bleu violette et dont le maximum d’absorbance est de 570 nm.

Cette réaction va se dérouler en deux étapes :

- on aura une libération d’un NH3 selon la réaction suivante :

- puis on aura la condensation du NH3 qui a été avec la ninhydrine et l’hydrantine selon la réaction suivante :

Ainsi, par la succession de ces réactions, on obtient le pourpre de Ruhuemann et des molécules d’eau.

Pour

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