TP Alanine-Arginine

Le but de ce TP est de séparer l’alanine et l’arginine en faisant une chromatographie échangeuse de cation, puis de déterminer la concentration de l’alanine grâce à un dosage spectrophotométrique et mettre en évidence l’arginine grâce à une réaction spécifique qui permet de la colorer.

Principes des méthodes utilisées :

Chromatographie échangeuse de cations

C’est une méthode qui repose sur la différence d’interaction entre les molécules chargées à séparer (ici l’alanine et l’arginine) et la phase stationnaire (ici la résine Amberlite IRC 50) sur laquelle sont greffés des acides carboxyliques (groupement négatif).

La résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l’échangeur d’ion soit ionisé. On dépose ensuite la molécule à séparer sur la colonne (ici la solution d’alanine et d’arginine). On réalise ensuite l’élution des molécules fixées sur la résine en augmentant le pH.

Plus précisément dans ce TP nos deux acides aminés ont des pHi différents, il faudra donc procéder en deux étapes :

Premièrement, on utilise une solution tampon dont le ph est inférieur au pHi d’un de nos deux acides aminés. La charge nette de cet acide aminé sera donc positive et il sera retenu par la phase stationnaire tandis que l’autre sera élué car son phi sera inferieur au ph du tampon, il aura une charge négative.

Deuxièmement, on utilisera une solution tampon dont le ph sera supérieur au phi de l’acide aminé retenu sur la phase stationnaire a l’étape une, il aura donc une charge négative et sera donc élué a son tour

Cette séparation nous permettra de réaliser un dosage spectrophotométrique.

Dosage spectrophotométrique : Cette méthode repose sur l’absorption d’un rayon lumineux d’une solution colorée à une longueur d’onde choisie afin de connaitre sa concentration grâce à la loi de Beer-Lambert A = ε.l.C. Ici on ne connait pas ε, il faudra réaliser une gamme de solution étalons qui contiennent notre molécule d’intérêt et de concentrations différentes, mesurer leur absorbance grâce à un spectrophotomètre et tracer une droite dont on calculera l’équation afin de trouver la concentration de l’espèce recherchée. La droite représente l’absorbance en fonction de la concentration. De plus l’alanine n’étant pas coloré il faut impérativement la colorer grâce à un réactif à la ninhydrine et à l’hydrindantine. Il ne faudra pas oublier de réaliser l’essai à blanc de la gamme étalon dont l’absorbance est due uniquement aux réactifs. L’absorbance de ce dernier sera soustraite à celle de tous les autres tubes afin d’obtenir leur absorbance réelle.

3 Résultats et interprétations.

Dosage de l’alanine : On commence par préparer 10 mL de solution standard d’alanine à 20µg/mL par dilution de la solution-mère à 80mg/200mL.

On doit avoir les mêmes unités de concentration donc 80mg/200mL équivaut à 400mg/mL

Calcul du volume à prélever : On a une conservation de la quantité de matière donc ni=nf ce qui équivaut à Ci*Vi=Cf*Vf.

Vf= (Ci*Vi)/Cf

Vf=( 20*10)/400 =0.5mL. On rajoute 9.5mL d’eau distillée pour avoir notre solution.

Mise en évidence de l’arginine : on prépare 10mL d’a-napthol à 0.1% dans le mélange éthanol-eau (50 :50).

On a 0.1g pour 100Ml donc pour 10Ml on aura besoin de 0.01g d’a-naphtol.

Les

...