TP Séparaion alanine-arginine

TP1:Séparation​ ​de​ ​l'alanine​ ​et​ ​de​ ​l'arginine​ ​sur​ ​résine​ ​échangeuse​ ​d'ions

1) But Le but de ce TP est de séparer deux acides aminés constituant un peptide: L’Arginine (R) et l’Alanine (A) par une hydrolyse, par chromatographie échangeuse d’ions, par un dosage de l’acide​ ​aminé​ ​(A)​ ​puis​ ​la​ ​mise​ ​en​ ​évidence​ ​de​ ​(R).

2)​ ​​​ ​Principe Pour​ ​séparer​ ​ces​ ​deux​ ​acides​ ​aminés,​ ​nous​ ​réalisons​ ​plusieurs​ ​expériences:

- Chromatographie​ ​par​ ​échangeuse​ ​d’ions:

Cette méthode consiste à séparer les molécules chargées électriquement, ionisées d’un mélange​ ​également​ ​chargé. La phase stationnaire (solide) peut contenir soit des groupements fonctionnels anioniques (pour les échanges de cations), soit cationiques (pour les échanges d’anions). Ici, la phase stationnaire est une matrice (Amberlite IRC 50) contenant un groupement fonctionnel, l’acide carboxylique. Or, l’utilisation d'une résine anionique dans une colonne permet l’échange de cations. En effet, elle retient les acides aminé sous forme cationique c’est à dire chargés positivement. La​ ​phase​ ​mobile​ ​liquide​ ​est​ ​une​ ​solution​ ​tampon​ ​acétate​ ​0,1mol.L-1​ ​pH4,2. On filtre le mélange des acides aminés à analyser à travers la résine échangeuse de cations. Si les acides aminés sont chargés négativement ou nulle à pH4,2, ils ne seront pas ou peu retenus. Inversement, si leur charge est positive à ce pH, ils seront retenus par la résine chargée négativement. En effet, à un pH acide par rapport à leur pHi les acides aminés se trouvent sous forme de cations. On va alors éluer les acides aminés en utilisant des solutions tampons pour augmenter le pH : tampon acétate 0.1 M pH4.2 puis tampon acétate​ ​4M​ ​pH5,5.

● Préparation​ ​de​ ​la​ ​colonne Il y a une équilibration des charges de la résine en utilisant la solution tampon acétate 0,1mol.L-1 pH4,2 (groupement acide carboxylique, résine chargée négativement) après un lavage​ ​de​ ​la​ ​résine​ ​par​ ​du​ ​NaOH​ ​2mol.L-1​ ​et​ ​du​ ​HCl​ ​2mol.L-1​ ​(neutralité).

● Fixation​ ​des​ ​solutés​ ​sur​ ​la​ ​résine Selon la charge du groupement amine de l’acide aminé, celui-ci sera plus ou moins retenu par la résine. Si le groupement amine de charge positive prend la place du Na+, l’acide aminé​ ​se​ ​trouve​ ​alors​ ​“lié”​ ​à​ ​la​ ​résine.

● Elution​ ​de​ ​l'alanine​ ​et​ ​de​ ​l’arginine Si le pHi de l’acide aminé est inférieur au pH du tampon, l’acide aminé sera retenu par la résine​ ​car​ ​elle​ ​est​ ​chargée​ ​positivement.​ ​On​ ​pourra​ ​l’éluer​ ​en​ ​augmentant​ ​le​ ​pH​ ​du​ ​tampon. Pour que les acides aminés soient libérés, il faut que le pH de la phase mobile deviennent supérieur​ ​à​ ​leur​ ​pHi.​ ​Le​ ​groupement​ ​amine​ ​sera​ ​alors​ ​de​ ​charge​ ​neutre​ ​(NH​2​).

- Dosage​ ​de​ ​l’alanine​ ​par​ ​spectrophotométrie La spectrophotométrie est une méthode d'analyse qui permet de déterminer l'absorbance d'une substance chimique en solution, c'est-à-dire sa capacité à absorber la lumière qui la traverse. Cette méthode permet donc de mesurer l’absorbance de l’éluat d’alanine au cours de la chromatographie​ ​afin​ ​de​ ​tracer​ ​la​ ​courbe​ ​d’élution. L'absorbance d'une substance chimique dépend de la nature et de la concentration de cette substance. Un spectrophotomètre mesure l'absorbance d'une solution à une longueur d’onde donnée. Dans la pratique, l'appareil réalise une mesure de l'intensité de la lumière après son passage au travers d'une cuve contenant la solution à étudier. L'intensité de la lumière monochromatique émise (I​0​) est connue. À partir de la mesure de l'intensité de la lumière​ ​transmise​ ​(I),​ ​l'appareil​ ​donne​ ​l'absorbance​ ​(A)​ ​selon​ ​la​ ​formule​ ​suivante​ ​:

A​ ​=​ ​log(I0/I)

Pour déterminer la concentration on utilise la loi de Beer-Lambert. L'absorbance est proportionnelle à la concentration d'une solution. Une mesure de l'absorbance peut donc permettre​ ​de​ ​remonter​ ​à​ ​la​ ​concentration​ ​d'une​ ​solution.

- Dosage​ ​alanine Le dosage repose sur l'apparition d'une coloration violette résultant de la condensation de NH3, libéré par l'acide aminé, et d'une molécule de ninhydrine et d'hydrindantine, en milieu alcalin. Après préparation des différents tubes pour l’analyse, nous effectuerons une lecture de l’absorbance, mesurée par un spectrophotomètre. Plus la solution est concentrée plus elle​ ​absorbe​ ​la​ ​lumière​ ​dans​ ​les​ ​limites​ ​de​ ​proportionnalités.

Figure

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1:

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