SEPARATION DE L’ALANINE ET DE L’ARGININE SUR RESINE ECHANGEUSE D’IONS

SEPARATION DE L’ALANINE ET DE L’ARGININE SUR RESINE ECHANGEUSE D’IONS

But :   Le but de ce TP est de séparer l’alanine et l’arginine d’un mélange (dans notre cas, le mélange B ) afin de déterminer la concentration initiale de chacun des acides aminés présents dans le mélange. Tout d’abord nous allons séparer les acides aminés à l’aide d’une chromatographie échangeuse d’ion. Puis nous effectuerons un dosage spectrophotométrique sur l’alanine afin de déterminer sa concentration initiale et en déduire la concentration de l’arginine par des calculs. Enfin nous vérifierons l’efficacité de notre séparation à l’aide des réactifs d’alpha naphtol et d’hypobromite de sodium pour mettre en évidence l’arginine.

Principe :

- Chromatographie échangeuse d’ions : C’est une chromatographie qui permet de séparer les molécules ( dans notre cas, les acides aminés ) en fonction de leurs charges. En effet, les acides aminés peuvent avoir des charges positives, négatives ou neutres en fonction de l’indice de pH de leur milieu. De plus chaque acide aminé étant différent des autres, ils ne possèdent pas les mêmes charges pour un même pH donnée. Ainsi pour séparer un mélange d’acides aminés, nous utiliserons une résine, qui constituera notre phase stationnaire, et qui sera chargée positivement ou négativement en fonction des cas. La phase mobile sera le mélange d’acides aminés. Donc une résine chargée positivement retiendra les acides aminés chargés négativement et une résine chargée négativement retiendra les acides aminés chargés positivement. Une résine chargée positivement est une résine anionique puisqu’il y a un échange d’anions. Et une résine chargée négativement est une résine cationique puisqu’il y aura un échange de cations. Une fois que la séparation a eu lieu, on peut ajouter une solution tampon avec un indice de pH permettant de modifier la charge des acides aminés, retenus par la résine, de sorte que celles-ci soient éluées à leur tour.

- Réaction à la ninhydrine : Tous les acides aminés possèdent un groupement acide carboxylique (COOH) et amine (NH2). La ninhydrine est un composé aromatique révélateur des acides aminés. La réaction se déroule entre le groupement amine  et une molécule de ninhydrine entrainant la formation d’une imine, une décarboxylation puis la formation d’une nouvelle imine avec une deuxième molécule de ninhydrine. Cette réaction entraine ainsi la formation d’un composé coloré (pourpre de Ruhemann) dont l’absorbance s’effectue à 570 nm.

- Dosage spectrophotométrique : C’est une technique permettant de déterminer la concentration d’une solution inconnue à l’aide d’une gamme étalon tracée à partir des valeurs d’une solution dont on connait la concentration. L’absorbance étant proportionnelle à la concentration, selon la loi de Beer-Lambert, nous tracerons une courbe d’étalonnage pour retrouver la concentration de la solution qui nous intéresse.

- Réaction d’alpha naphtol et d’hypobromite de sodium : L’alpha naphtol est un réactif possédant un groupement hydroxyle (OH) pouvant se fixer sur le groupement amine (NH2) de la chaine latérale d’un acide aminé. Le réactif d’hypobromite peut se fixer sur l’alpha naphtol et émettre ainsi une coloration. Ainsi l’alpha naphtol possédant un système conjugué, permet d’accentuer la coloration de la solution d’acide aminé permettant de le mettre en évidence.    

Résultats et interprétation :

On voit qu’à pH 4.2, l’alanine est en équilibre A+/A0 avec la forme neutre (A0) qui est présente en majorité puisque le pHi ( pH pour lequel la charge globale d’un acide aminé est neutre) de l’alanine est de 6,015 et le pH pour lequel ce dernier possède une charge positive est de 2.34. Ainsi l’alanine sera élué, tandis que l’arginine, à un pH de 4.2, se trouve dans un équilibre ionique  R2+/R+ .  Ainsi cet acide aminé sera retenu par notre résine, l’Amberlite IRC 50, car il possède un pHi de 10.76.

Si on utilise un tampon de pH de 14, on remarque que l’arginine se trouve dans un équilibre R0/R- avec la forme R- qui est plus présente puisque le pH pour lequel l’arginine possède une charge négative est de 12.48. Ainsi dans un milieu avec un indice de pH 14, l’arginine sera élué à son tour.

pHi ( Alanine) = 2.34+9.69 = 12.03/2 = 6.015

pHi (Arginine) = 9.04+12.48 = 21.52/2 = 10.76

 Le tube 1 représente l’essai à blanc de l’expérience menée sur les six premiers tubes, nécessaires pour pouvoir tracer une gamme étalon. Le tube 1 contient tous les réactifs nécessaires pour réaliser l’expérience, sauf l’alanine qu’est notre molécule d’intérêt. De même, le tube 9 représente l’essai à blanc de l’expérience réalisé pour les tubes 7 et 8, car il contient tous les réactifs nécessaires sauf le filtrat que nous allons étudier.

...