TP : SEPARATION DE L’ALANINE ET L’ARGININE SUR RESINE ECHANGEUSE D’IONS

UE : BIOCHIMIE EXPERIMENTALE 1

SEQUENCE 3

GROUPE A

TP : SEPARATION DE L’ALANINE ET L’ARGININE SUR RESINE ECHANGEUSE D’IONS

BUT :

Ce TP a pour but de séparer les acides aminés d'un mélange (B). L'alanine et l'arginine sont dissociés grâce à la chromatographie échangeuse d'ions de type échangeuse de cations, puis réaliser un dosage grâce au spectrophotomètre et enfin une mise en évidence de l'arginine grâce à des réactifs qui colorent l'acide aminé concerné.

PRINCIPE :

La chromatographie échangeuse d’ions permet de séparer des molécules suivant leurs charges par variation du pH. On utilise pour cela une phase stationnaire qui est une résine chargée accompagner d’un contre ion de charge opposée. On sait que les acides aminés possèdent des groupements ionisables qui leur confèrent des charges globales (+), (-) ou neutres suivant le pH fixé. Le pHi ou pH isoélectrique est le pH pour lequel un acide aminé a une charge de 0 : chaque acide aminé en a un différent. Donc pour séparer un mélange d’acide aminé il suffit de faire passer la phase mobile (mélange d’acides aminés) dans la phase stationnaire (résine). Les acides aminés vont entrer en compétition avec le contre ion qui va être élué. Si la résine est chargée positivement elle retiendra des acides aminés chargés négativement : on parle de résine échangeuse d’anions. Si c’est l’inverse on parle de résine échangeuse de cations. Par la suite l’ajout de tampon à différent pH va permettre de modifier de façon sélective la charge des acides aminés contenus dans le mélange. Ceux qui auront une charge nulle ou similaire à celle de la résine seront élués et ainsi on pourra récupérer les acides aminés les uns après les autres.

Dans notre cas la phase stationnaire est la résine Amberlite IRC 50 qui est chargé négativement et qui retient donc des acides aminés chargés positivement : sous forme cationique. Il s’agit d’une chromatographie échangeuse de cations. La phase mobile est un mélange contenant deux acides aminés : l’alanine et l’arginine. Le critère de séparation est la charge globale des acides aminés (qui dépend du pH).

Les acides aminés sont des molécules qui possèdent une structure commune composée d’au moins un groupement acide carboxylique (COOH) et amine (NH2). La ninhydrine est une molécule qui a la particularité de réagir avec les acides aminés pour former un composé coloré nommé pourpre de Ruhemann. La réaction a lieu via le groupement amine et une molécule d’hydrindantine (forme réduite de la ninhydrine) par formation d’une imine puis décarboxylation qui se déroule à haute température (d'où la nécessité d’un bain-marie). Ensuite l’hydrolyse de l’imine et la condensation d’une autre molécule de ninhydrine permet d’aboutir à la pourpre de Ruhemann qui absorbe la lumière à 570 nm car elle possède un système conjugué. La réaction s’effectue en milieu alcalin pour que le groupement NH3+ de l’acide aminé libère son proton.

Une fois que la solution est colorée on peut effectuer un dosage spectrophotométrique qui est une technique permettant de déterminer la concentration d’une solution inconnue à l’aide d’une gamme étalon. D’après la loi de Beer Lambert, l’absorbance est proportionnelle à la concentration donc en effectuant une gamme étalon grâce à des solutions dont on connaît la concentration on peut tracer une droite d’étalonnage pour ensuite retrouver la concentration d’une solution inconnue (équation de la droite).

Pour finir la mise en évidence de l’arginine repose sur une réaction spécifique avec l’apha-naphtol et l’hypobromite de sodium. La réaction repose sur la fixation de deux molécules d’alpha-naphtol par leur groupement hydroxyle (OH) sur le groupement amine (NH2) de la chaîne latérale de l’arginine. Le brome se fixe sur l’alpha-naphtol pour ensuite émettre une couleur orangée. De plus l’alpha-naphtol est une molécule possédant un système conjugué qui permet d’absorber la lumière et donc de donner une couleur intense à la solution d’arginine.

RESULTATS ET INTERPRETATION :

pH Formes ioniques en présence

4,2

Equilibre A0 / A+ et équilibre R+ / R2+

14 (soude)

Equilibre R- / R0

A pH = 4,2 c’est-à-dire le pH du tampon acétate 0,1M pH 4,2 , on remarque que l’alanine est en équilibre sous les formes A0 / A+ avec une majorité de A0. A0 n’est donc pas retenu par la résine Amberlite (-) et est élué et récupéré dans la fiole jaugée. Ensuite il y a un déplacement de l’équilibre A0 / A+ vers les formes A0 qui est encore élué. Ce processus continue jusqu’à élution de toute l’alanine.

L’arginine est en équilibre R+ / R2+ donc toujours retenu par la résine Amberlite (-).

A pH = 14, le pH de la soude, l’arginine est en équilibre R- / R0 donc n’est plus retenu par la résine chargée (-).

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