Compte-rendu TP Séparation du lactose et protéines du lait

G.M                                                                                       Groupe TD 1.6

UE Biochimie

Compte-rendu TP III Séparation du lactose et protéines du lait

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I- Introduction

Le lait, produit d’origine animal, contient trois types de constituants : des protéines, des glucides et des lipides.

Les protéines du lait sont essentiellement représentés par les caséines (masse moléculaire d’environ 35 kDa = 35000 g.mol-1).

On trouve également du lactose (ou β-D-galactopyranosyl(1→4)D-glucopyranose) qui est un disaccharide et a donc une masse moléculaire (342 Da) nettement plus faible à celle des caséine qui étant des polypeptides sont des enchainements d’acides aminés qui représentent chacun environ 110 Da.

II- Objectif de la manipulation

Dans cette manipulation, il nous a été proposé d’étudier l’ordre d’élution des différents constituants du lait tout d’abord en les séparant les uns des autres par chromatographie d’exclusion puis de détecter leur présence dans nos différentes fractions par spectrophotométrie pour les protéines et par réaction à la liqueur de Fehling pour les oses.

III- Principe des techniques utilisées

Dans cette partie nous présenterons les principes des différentes techniques d’étude utilisées au cours de la manipulation.

Technique de la filtration sur gel, ou chromatographie d’exclusion

Cette méthode de séparation va permettre d’éluer les différents constituants de l’échantillon, introduit dans la colonne de chromatographie, en fonction de leur taille et donc de leur masse moléculaire.

En effet le gel utilisé dans cette méthode de filtration (ici du Séphalex G-25) ne va pas interagir par affinité chimique avec nos macromolécules d’intérêt (comme dans la chromatographie d’affinité) mais permettra de les séparer car les billes qui le composent forment un réseau tridimensionnel que seules les molécules de faible masse moléculaire pourront pénétrer. Elles verront ainsi leur temps de séjour dans la colonne prolongé par rapport aux macromolécules de haute masse moléculaire qui elles ne s’inséreront pas parmi les microbilles et s’éluderont sans temps de retard. Les grosses molécules, totalement exclues du gel, seront éluées avec un volume de solvant égal à V0 (appelé volume mort, il correspond au tiers du volume total de la colonne) alors que celles de plus petite masse moléculaire, qui circuleront plus longtemps dans la colonne, sortiront avec un volume de tampon supérieur, égal à Ve = V0 + Kd Vi avec Kd qui est une constante propre à chaque molécule et qui varie inversement proportionnellement au logarithme de la masse moléculaire de la molécule considérée.

Spectrophotométrie

Les protéines sont un enchainement d’acides aminés unis par des liaisons dites peptidiques qui ont la particularité d’absorber la lumière pour une longueur d’onde égale à 280 nm. La spectrophotométrie utilise cette propriété pour détecter leur présence et même doser leur concentration grâce à la loi de Beer-Lambert :

                                        (avec A : absorbance, l : largeur de la cuve                                    et c : concentration molaire).[pic 3]

Le spectrophotomètre émet une onde lumineuse dont le manipulateur règle la longueur d’onde. L’onde, d’intensité initiale I0 traverse la cuve de mesure où se trouve l’échantillon d’intérêt et ressort avec une intensité moindre, notée I. On peut ainsi mesurer l’absorbance qui est inversement proportionnelle à la masse molaire :

Réaction à la liqueur de Fehling

La liqueur de Fehling est une solution renfermant des ions Cu2+, de couleur bleue en milieu basique.   À chaud, en présence d’une substance réductrice, la liqueur de Fehling donne un précipité rouge d’oxyde de cuivre Cu2O. On va donc ajouter de la base dans les fractions obtenues par chromatographie et mettre le tout à chauffer et on pourra ainsi identifier celles qui contiennent des oses et celles qui n’en ont pas. En effet le lactose est un disaccharide et conserve la fonction réductrice du carbone anomérique du glucose libre. Il y aura donc formation d’un précipité rouge brique si la présence d’ose est détectée.

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