Fractionnement cellulaire, isolement et caractérisation des mitochondries

UE BIOLOGIE CELLULAIRE BI

Fractionnement cellulaire, isolement et caractérisation des mitochondries

16/02/17, 21/02/17

PELLEGRIN Liza, liza.pellegrin@etu.univ-amu.fr, L1 SV 4a

Introduction

Présente dans chez la plupart des eucaryotes, la mitochondrie est un organite intracellulaire composé d'une double membrane et qui possède son propre génome. Il joue un rôle majeur dans la production d'énergie de la cellule.

L'énergie produite par les mitochondries provient de l'oxydation de composés organiques tels  que le glucose. Cette énergie directement utilisable se trouve sous forme d'ATP.

On observe deux mécanismes fondamentaux dans la production d'énergie par les mitochondries : la respiration et la fermentation, qui entre en jeu lorsque l'apport en dioxygène est faible (en revanche ici l'oxydation du glucose sera incomplète et par conséquent le bilan énergétique de la fermentation sera bien plus faible que celui de la respiration) comme on peut le voir sur la figure 1 ci-desous/en annexe ?

fig 1

Dans ce TP que nous avons réalisé en 4 heures, nous avons cherché à mettre en évidence ces réactions d'oxydo-réduction du métabolisme respiratoire des mitochondries. Afin d'y parvenir, nous avons isolé les mitochondries par fractionnement cellulaire puis nous avons étudié l'activité « succinate-cytochrome c réductase » de la chaîne respiratoire mitochondriale.

Lors du fractionnement cellulaire, les mitochondries doivent être isolées afin de ne pas être contaminées par d'autres organelles telles que les chloroplastes. Nous avons pour ceci eu recourt à la technique de centrifugation différentielle pour obtenir des culots plus purs.

Nous avons fait le choix pour ce TP de travailler sur des mitochondries provenant de pommes de terre, le coût étant moindre et la manipulation plus facile.

Matériel et méthodes

Nous avons procédé en 4 grandes étapes : le broyage, les centrifugations différentielles, le lavage ainsi que la mise en évidence de l'activité « succinate-cytochrome c réductase ».

• Tout d'abord, nous avons procédé à la préparation des mitochondries. Il nous fallait d'abord éplucher les tubercules de pomme de terre afin d'isoler les mitochondries des chloroplastes présents à leur surface et qui à cause de leur mécanisme de photosynthèse pourraient fausser nos résultats. Nous avons ensuite coupé les pommes de terre en petits morceaux et ajouté du milieu broyage avant de broyer le tout et de filtrer le broyat. Le tampon de broyage permet aux lisosomes de lyser les cellules en raison de l'action de nombreuses protéases.
• Dans le but d'isoler les mitochondries du parenchyme de pomme de terre, nous avons réalisé des centrifugations différentielles. Cela ((( Il a été nécessaire pour cela de faire 3 centrifugations : après avoir récupéré le filtrat, nous avons fait une première centrifugation d'une durée de 15 minutes. A l'issue de ces 15 minutes nous avions obtenu un surnagent contenant les mitochondries qui nous intéressent ainsi que d'autres organites peu denses (surnageant que nous avons évidemment récupéré pour la centrifugation suivante) et un culot contenant d'autres organelles plus denses. Après avoir centrifugé pendant 15 minutes une nouvelle fois et récupéré de nouveau le surnagent, nous avons disposé ce dernier dans un tube d'ultracentrifugation (plus résistant qu'un tube classique, étant donné la grande différence de gravité) puis nous l'avons placé dans une ultracentrifugeuse pendant 20 minutes. Enfin, nous obtenions un surnageant que nous avions jeté ainsi qu'un culot constituant un extrait brut de mitochondries de couleur marron-rouge (en raison des atomes de fer des cytochromes).
• Notre troisième étape consistait à laver nos mitochondries. Nous avons additionné dans le culot produit dans l'étape précédente une solution de broyage sans cystéine puis nous avons ultracentrifugé le tout pendant 20 minutes. Le surnageant a ensuite été jeté puis le culot additionné avec du tampon phosphate et enfin homogénéisé pour faire éclater les mitochondries et faire apparaître la membrane interne.
• Dans la quatrième et dernière étape (schématisée en annexe) nous avons mis en évidence l'activité « succinate-cytochrome c réductase » en utilisant un spectrophotomètre. 3  cuves ont alors été préparées avec dans la cuve 1 (que nous allons utiliser comme blanc de référence puisque ((( ) du cytochrome c oxydé, du tampon phosphate ainsi que la fraction mitochondriale (réchauffée et donc activée), dans la cuve 2 du cyanure, ce dernier ayant (((, du succinate, du cytochrome c, du tampon phosphate et de la fraction mitochondriale ont été additionnés et dans la cuve 3, les même éléments que la cuve 2 ont été ajoutés à l'exception du cyanure.

Nous avons ainsi pu mesurer l'avancement de la réaction à 550nm car (((

 Afin de garder (((nous avons bien évidemment pris soin de manipuler les récipients, tampons et solutions à froid dans de la glace pilée durant chaque étape. (Aussi, j'ai jugé inutile de préciser que toutes les centrifugeuses étaient réfrigérées).

Résultats, discussion et interprétation

Voici les résultats finaux obtenus lors de la dernière étape

courbe

-Décrire la putain de courbe

-Expliquer notes

Conclusion

Conclure

...