Fractionnement Cellulaire: Isolement Et Caractérisation Des Mitochondries

Introduction

Les mitochondries sont des organites de quelques micromètres présents uniquement dans les cellules eucaryotes. Elles sont constituées de deux membranes et possèdent leur propre matériel génétique, sous la forme d’ADN circulaire. La membrane externe contient, entre autre, des porines et des translocases, lui conférant une perméabilité aux molécules de quelques kiloDaltons. La membrane interne présente elle de très nombreux replis, appelés crêtes mitochondriales, permettant ainsi d’augmenter sa surface et donc les échanges entre l’espace intermembranaire et l’espace matriciel. C’est dans ce dernier que se déroule une partie du métabolisme du glucose. Tout d’abord, il est dégradé en pyruvate dans le cytosol de la cellule, par le mécanisme de la glycolyse, en anaérobie, c’est-à-dire en l’absence d’oxygène. Le pyruvate ainsi formé traverse les deux membranes mitochondriales et rejoint la matrice, où il est transformé en acétyl-coenzyme A, ce qui constitue la deuxième voie métabolique. Cet acétyl-CoA entre ensuite dans le cycle de l’acide citrique (cycle de Krebs), dans lequel sont produites des molécules de NADH, FADH2 et GTP, en passant notamment par la formation de succinate et fumarate.

La glycolyse du cytosol produit 2 ATP directement utilisables et 2 NADH par molécule de glucose. Dans la mitochondrie, la formation d’acétyl-CoA à partir de pyruvate génère une molécule de NADH et le cycle de Krebs, quand à lui, permet la production de 1 GTP, 3 NADH et 1 FADH2. Ces différentes molécules sont ensuite utilisées par les complexes de la chaîne respiratoire de la mitochondrie pour synthétiser de l’ATP, sachant qu’un NADH fournit 3 ATP et qu’un FADH2 fournit 2 ATP. Au final, à partir d’une molécule de glucose, la cellule produit 36 molécules d’ATP, dont 34 provenant de la mitochondrie (figure 1). Cependant, en l’absence d’oxygène le pyruvate ne peut rejoindre la matrice mitochondriale, il est alors transformé en acide lactique dans le cytosol, ramenant le bilan énergétique à seulement 2 ATP.

Le but de ce TP est de mettre en évidence des réactions d’oxydo-réduction du métabolisme respiratoire au niveau des mitochondries, en les isolant par fractionnement cellulaire et en mesurant l’activité succinate-cytochrome c réductase, in vitro, de la chaîne respiratoire. Pour cela on va extraire les mitochondries du parenchyme de pomme de terre par centrifugations différentielles, pour ensuite préparer une fraction mitochondriale nous donnant accès à la membrane interne, et par conséquent aux chaînes respiratoires. On va ainsi pouvoir étudier l’activité succinate-cytochrome c réductase en mesurant le passage du cytochrome c de la forme oxydée à la forme réduite à l’aide d’un spectrophotomètre.

Matériel et Méthodes

Broyage

La première étape de notre manipulation consiste à isoler les mitochondries présentes dans les pommes de terre. Pour cela nous les avons épluché et lavé, afin d’éliminer les chloroplastes présents à leur surface. En effet ces organites sont à l’origine de la photosynthèse, mécanisme énergétique qui fausserait nos résultats. Après les avoir coupé en petits cubes, on les place dans un mixeur en présence d’un tampon de broyage composé de Tris-HCL, saccharose, EDTA, BSA et Cystéine. Le Tris-HCL nous permet de tamponner le milieu afin de ne pas avoir de variation de pH. Le saccharose va quant à lui créer un choc osmotique, c’est-à-dire un échange d’eau avec les cellules. La concentration dans la cellule étant inférieure à celle du milieu extracellulaire, il va se produire une entrée d’eau pour baisser cette concentration intracellulaire, ce qui va faire éclater la cellule. L’EDTA va inhiber les protéases en piégeant les ions Mg2+ et Ca2+, nécessaires à leur fonctionnement. Le BTA et la Cystéine vont finalement permettre de détourner l’activité des protéases qui n’auraient pas été inhibées. Le broyage effectué nous donne une solution contenant tous les organites et constituants cellulaires, après essorage et vérification du pH.

Centrifugations différentielles

Cette méthode nous permet de récupérer les différents composants cellulaires au fur et à mesure, afin de ne garder que ceux qui nous intéressent. On procède par une première centrifugation à 4500 rotations par minute (rpm) pendant 15 mn. On se débarrasse du culot, contenant les plus gros constituants, comme le noyau, pour ne garder que le surnageant, que l’on utilise pour réitérer l’opération de centrifugation. Le surnageant obtenu est centrifugé une troisième fois, à 10000 rpm pendant 30 mn. Cette fois ci on garde

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