TP Fractionnement Cellulaire Mitochondrie

Compte rendu TP de Biologie Cellulaire

Fractionnement cellulaire, isolement et caractérisation des mitochondries

1°) Introduction

Les mitochondries sont des organites cytoplasmique de environ 1 micromètres de longueur qui sont présent uniquement chez les eucaryotes. Les mitochondries possèdent leurs propres ADN et elles sont essentiels dans les processus énergétiques cellulaires. Les mitochondries sont formées d'une membrane externe, d'une membrane interne avec de nombreux replis et d'une matrice qui est l'espace entre les replis de la membrane interne.

Dans les mitochondries les nutriments subissent des réactions de simplification moléculaire. Les molécules issus de la simplification du glucose dans le cytoplasme vont être transformées jusqu'à la formation de dioxyde de carbone par un ensemble de réaction appelé "cycle de Krebs" qui se déroule dans la matrice mitochondriale. Les réactions du cycle de Krebs sont coordonnées avec des réactions de phosphorylations oxydative qui se déroulent au niveau des crêtes mitochondriales.

La dégradation complète d'une molécule de glucose fournit 38 molécules d'ATP.

Le but du TP est de mettre en évidence les réactions d'oxydo-réduction du métabolisme respiratoire sur des fractions mitochondriales. En isolant des mitochondries par fractionnement cellulaire et d'étudier l'activité succinate-cytochrome c réductase de la chaîne respiratoire.

2°) Méthodes

*Préparations des mitochondries ( manipulation à froid)

-Broyage

La première étape consiste à broyer des pomme de terre épluché en ajoutant du tampon de broyage. Nous avons éplucher les pommes de terre au préalable pour enlever les chloroplastes et nous avons ajouter le tampon de broyage car il lyse les cellules grâce au saccharose 0,4M qu'il contient ce qui produit un choc osmotique. C'est à dire la cellule meurt par éclatement de sa membrane plasmique.

-Centrifugation différentielles

Nous avons filtrer le mélange pour enlever les morceau des pomme de terre et placer le filtrat dans une centrifugeuse a 4500 rpm pendant 15 minutes. Le surnageant est transféré délicatement dans un nouveau pot de centrifugation pour y subir une deuxième centrifugation à 4500 rpm pendant 15 minutes.

Pour la troisième centrifugation nous avons utiliser une centrifugeuse fonctionnant à 10 000 rpm c'est à dire 1800 fois la gravité de la terrestre. Cette fois ci nous avons jeté le surnageant. Le culot constitue un extrait brut de mitochondries, colorations marron-rouge due aux atomes de fer des cytochromes. A toutes les étapes de centrifugation le pots à la sortie de la centrifugeuse est placés dans un bac à glace pour conserver les mitochondries.

Le culot 3 ( contenant les mitochondrie après la 3 centrifugation ) est ensuite additionner a une solution de lavage et le mélange est homogénéiser dans un Potter pour faire éclater les mitochondries et démasquer

...