FRACTIONNEMENT CELLULAIRE, ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES MITOCHONDRIES.

Compte rendu de TP de biologie cellulaire L1 SV :

FRACTIONNEMENT CELLULAIRE, ISOLEMENT ET CARACTERISATION DES MITOCHONDRIES.

Introduction

La mitochondrie est un organite ayant plusieurs rôles dont celui de la respiration cellulaire, présent généralement dans les cellules eucaryotes. Sa taille est d’environ 1 micromètre et présente des formes variées.

Pendant la glycolyse dans le cytoplasme, les molécules de glucose sont phosphorylées et donnent du pyruvate. Une fois dans la matrice, le pyruvate réagi et donne du CO2 grâce à l’acétyl-CoA et le cycle de Krebs (voir schéma en annexe). La respiration aérobie peut former 36 molécules d’ATP. La fermentation est un autre moyen de fabriquer de l’ATP grâce à la dégradation partielle du glucose en acide lactique dans le cytoplasme et ne fait pas intervenir la mitochondrie. Cependant, la fermentation fabrique seulement 2 molécules d’ATP.

Le but de ce TP sera donc de mettre en évidence les phénomènes d’oxydo-réduction du métabolisme respiratoire sur des fractions mitochondriales. Nous allons tenter d’extraire les mitochondries issues des pommes de terre par fractionnement cellulaire et d’étudier in vitro l’activité « succinate cytochrome c réductase » par spectrophotométrie.

Méthodes

Afin de réaliser ce TP, nous choisissons de travailler sur les pommes de terre épluchées car la peau contient des chloroplastes qui seraient susceptibles de fausser nos résultats. En effet, leur poids moléculaire est identique à celui des mitochondries et ils absorbent la lumière. Nous ajoutons à cela du tampon de broyage composé de tampon Tris-HCl qui a pour objectif de stabiliser le pH autour de 7,5. Il est également composé de saccharose présent ici pour lyser la cellule par choc osmotique. Si la pression osmotique extracellulaire (qui est égale à la pression osmotique de la mitochondrie) est supérieure à la pression osmotique du cytoplasme, l’H2O va entrer massivement dans la cellule et la faire éclater tout en protégeant la mitochondrie. Après l’éclatement, la cellule libère des lysosomes et autres substances qui risquent d’abimer l’échantillon. Le tampon de broyage contient donc de l’EDTA, du BSA et de la cystéine qui ont respectivement pour but d’inhiber les protéases, de protéger et de détourner l’activité protéasique. De plus, le travail à 4°C permet de ralentir l’activité enzymatique.

Après avoir broyé puis filtré les pommes de terre avec le tampon de broyage, on réalise une série de centrifugations. Les deux premières (à 4500 rpm pendant 15 min) vont permettre de faire sédimenter les gros morceaux ainsi que les noyaux et autres organites selon leur densité. De plus on va réaliser une centrifugation de 10000 rpm pendant 20 min pour récupérer seulement les mitochondries et autres organites de même poids moléculaire. On aura besoin d’éliminer la membrane externe pour avoir accès à la membrane interne. Pour cela, on va utiliser une solution de « lavage » qui va détruire la membrane externe. Après centrifugation nous obtiendrons les mitochondries sans membrane externe. L’utilisation du Potter va permettre de couper la membrane interne et ainsi exposer la surface interne où se déroule la respiration.

La mesure du succinate cytochrome c réductase va être réalisé par spectrophotométrie. Seul le cytochrome c réduit absorbe à 550 nm. On va donc avoir besoin d’inhiber le complexe IV de la chaîne respiratoire à

...