Fractionnement cellulaire, isolement et caractérisation des mitochondries

Introduction :

Les mitochondries sont des organelles qui sont situées dans le cytoplasme des cellules eucaryotes. Elles ont toutes les propriétés d’une cellule procaryote, cela peut s’expliquer par le fait qu’il s’agissait auparavant d’une cellule à part et qu’au fil du temps, celle-ci a connu une symbiose avec l’organisme de différents êtres vivants. Elle permet, à l’aide de la glycolyse, c’est-à-dire la dégradation du glucose en pyruvate ainsi que différentes réactions chimiques au niveau du cycle de Krebs, la synthèse de l’énergie de la cellule sous forme d’Acide Triphosphate (ATP).

La mitochondrie peut produire de l’énergie de deux manières différentes. La première, qui est le plus courante, correspond à la chaîne respiratoire. Elle permet l’obtention de 30 ATP. La deuxième correspond à la fermentation, possible seulement dans les muscles et qui génère de l’acide lactique. Celle-ci est plus rapide que la réaction de la chaîne respiratoire, seulement elle permet une production moindre que la première réaction qui correspond à la chaîne respiratoire puisqu’elle est seulement de deux ATP. Elle intervient lorsque l’organisme a besoin d’un apport rapide en énergie comme par exemple lors d’une effort physique intense.

Lors de ce TP, nous avons séparé les mitochondries des autres constituants de la cellule par fractionnement cellulaire afin de pouvoir observer l’activité « succinate-cytochrome c réductase » du métabolisme respiratoire à l’aide d’un spectrophotomètre.

Matériels et méthodes :

Premièrement, nous avons cherché à séparer les mitochondries en utilisant la méthode par fractionnement cellulaire :

Pour cela, nous avons commencé par éplucher les pommes de terre car la peau contient des chloroplastes qui ont la même densité que les mitochondries, si nous avions gardé la peau nous aurions obtenu les mitochondries ainsi que les chloroplastes dans le culot après centrifugations. Nous avons ensuite ajouté un tampon de broyage qui permet de lyser les cellules car il contient du saccharose en forte quantité ce qui permet de créer en choc osmotique et ainsi de faire exploser la cellule. Les centrifugations différentielles permettent d’isoler au fur et à mesure les mitochondries pour ainsi obtenir un culot constitué uniquement de mitochondries. Il faut conserver la fraction mitochondriale sur la glace car celle-ci permet de garder intact les molécules, c’est-à-dire qu’elle permet de figer l’activité des cellules et donc des organites.

Deuxièmement, nous avons mesuré l’activité « succinate-cytochrome c réductase » :

Le cyanure a pour rôle de bloquer le complexe quatre. En effet, celui-ci ne pourra plus se réoxyder et va donc bloquer la chaîne. Nous cherchons à étudier l’activité du complexe III, qui permet de réduire le cytochrome c. Pour faire cela, nous préparons trois mélanges. Le premier mélange est le mélange que nous allons utiliser pour faire le blanc car il contient du cytochrome c oxydé, du tampon phosphate et de la fraction mitochondriale, cela nous permettra de mesurer uniquement l’absorbance du cytochrome c dans les deux autres mélanges, car la fraction mitochondriale et le tampon phosphate absorbent aussi à 550nm. Le deuxième mélange contient, en plus des trois composés précédents, du succinate et du cyanure. Le cyanure empêche la cytochrome c de se réoxyder, il est donc réduit à cet instant. Le troisième mélange est composé de succinate, de cytochrome c oxydé, du tampon phosphate et de la fraction mitochondriale. On mesure l’avancement de cette réaction au spectrophotomètre, à 550nm car c’est à cette valeur de l’absorbance car elle correspond à celle du cytochrome c, elle ne sera ainsi pas perturbée par l’ajout de cyanure, de tampon phosphate ou de succinate puisqu’elle est négligeable pour eux à cette valeur.

Résultats et discussion :

Les mesures de l’absorbance des mélanges 2 et 3 permettent d’obtenir deux courbes bien différentes.

En effet, pour la courbe du mélange 2 (bleue), nous pouvons observer une augmentation rapide de l’absorbance, puisqu’elle passe de 0,509 à 0,959 en 1 minute, puis une stabilisation de l’absorbance en fonction du temps autour de 0,900. Cette croissance peut s’expliquer par la présence du cyanure, qui, en bloquant l’oxydation du cytochrome c réduit pendant l’activité du complexe IV, entraîne une augmentation de ce dernier jusqu’à un épuisement total de cytochrome c oxydé se trouvent dans la solution. En effet, le cyanure empêche la chaîne respiratoire de continuer à s’oxyder. De ce fait, le cytochrome C réduit ne peut plus donner ses électrons au complexe IV vu qu’il est sous une forme réduite. La chaîne est donc bloquée. La stabilisation de l’absorbance du cytochrome c oxydé peut indiquer un arrêt de production de cytochrome C réduit. Cet arrêt peut avoir deux causes possibles. La première cause peut correspondre à une carence en cytochrome C oxydé. La deuxième cause semble indiquer un manque de succinate qui est le fournisseur d’électrons au cytochrome C oxydé.

La courbe du mélange 3 (rouge) correspond à l’évolution du cytochrome C réduit sans présence de cyanure. Nous sommes dans un environnement normal pour les mitochondries, avec les mêmes composants qui sont présents dans l’organisme, c’est-à-dire que tout devrait fonctionner correctement. La chaîne respiratoire devait pouvoir s’oxyder et se réduire normalement. Nous avons ici une forte diminution de l’absorbance du cytochrome C oxydé. En effet, nous passons de 0,062 à t=0 à -0,003 à t=1. Nous avons ensuite des valeurs négatives en diminution constante. Ce résultat n’est pas possible à obtenir. Cette erreur pourrait s’expliquer par le fait que nous aurions pu faire une erreur dans le dosage des substances présentes dans le mélange 3. Si nous n’avions pas mis les mêmes concentrations que dans le mélange 1 qui était notre témoin, nous aurions pu obtenir de type de courbe. En effet, en mettant moins de concentration de cytochrome C oxydé, le blanc réalisé avec le mélange 1 n’étant plus le même, du au changement de concentration, nous aurions pu obtenir des valeurs négatives semblables à celles obtenues.

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