TP DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

TP de Biologie Moléculaire

Résumé :

Le but de ce Tp est de cloner des fragments d’ADN grâce au phage lambda. Le premier

 jour, nous avons réalisé des digestions ainsi qu’une ligation. Par la suite, nous avons

effectué une analyse par électrophones des fragments d’ADN produits lors des digestions.

Le deuxième jour, nous avons isoler les clones, extrait l’ADN des bactéries et digérer

avant de réaliser une électrophorèse des fragments d'ADN qui ont été produits pendant

les digestions.

Abréviations :

ARN : Acide ribonucléique

ARNt : Acide ribonucléique de transfert

ADN  : acide désoxyribo nuléique

ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire

ADNg : acide désoxyribonucléique génomique

ATP : Adénosine triphosphate

pBS : Plasmide P bluescript

BET : Bromure d'Ethidium

Introduction :

Le problème biologique que l’on aborde tout au long de ce TP est le clonage d’un

 fragment d’ADN. L'objectif est, en outre, l'utilisation d'un vecteur de clonage. Un vecteur

 est un plasmide(c'est à dire un fragment d'ADN double brin situé dans le cytoplasme des

 bactéries)  recombiné permettant de cloner des gènes grâce à son mode de réplication.

 Le plasmide en se recombinant avec un fragment d'ADN avant d'être intégré dans une

 bactérie favorise la multiplication des fragments d'ADN. D'autre part, ces fragments sont

 tous identiques, ce qui est important pour la fiabilité des résultats. Au cours de ce TP, les

 vecteurs de clonage utilisés sont le bactériophage LAMBDA et le plasmide pBS

Résultats et discussion :

Le résultat est visible sur les photos du gel que l’on a effectué. En effet, nous pouvons

 observer tout d’abord une première colonne, qui est donc la colonne témoin, puis nos

trois résultats se situent sur les colonnes *************. On peut noter la différence de taille

visible sur ces bandes, et qu’il y a une migration plus ou moins importante. Les différentes

bandes représentent différents fragments D’ADN.

Concernant les boites de pétri, mes résultats n'étant pas concluants pour les boites 2 et 3,

 (il y a surement eu un inversement des numerotation des boites par rapport aux résultats

 visibles) Mais pour m'appuyer sur une experience, je me suis donc aidé des boites de

 pétri d'un camarade.

Ainsi, ce que je peux en déduire, ce sont les résulats suivant :

- Boite 1 :

Nombre de bactéries bleues : 29

Nombre de bactéries blanches : 21

-Boite 2 :

Nombre de bactérie bleues : 8

Nombre de bactéries blanches : 4

-Boite 3 :

Nombre de bactéries bleues : 65

Nombre de bactéries blanches : 0

Ce que nous pouvons remarquer, c'est que les bactéries bleues sont présentes en plus

 grande quantité que les blanches. En effet, si le plasmide est non recombiné, les

 bactéries sont bleues, mais si le plasmide est recombiné, elles sont blanches. Par

 ailleurs, les colonies bleues ne sont pas forcément non recombinantes car si le fragment

 d'ADN est trop petit, la séquence pour la β-galactosidase peut être lue. Il y a donc des colonies

 qui contiennent un plasmide non recombinant car ces dernière ont pu survivre à l'ampicilline grâce

 à la présence d'un plasmide. Nous constatons d'autre part que pour la troisième boite de pétri, il n'y

 a pas de bactéries blanches, et donc, pas de plasmide recombiné. On déduit d'ADN λ  empêche le

 clonage.

Conclusion :

Nous avons cloné des fragments d'ADN en utilisant un plasmide pour multiplier les

 fragments et donc avoir une grande quantité de fragments d'ADN à analyser. Par la

 réalisation de ce clonage, on a réussi à créer une banque, c'est à dire une collection de

 clones de bactéries ou de phages ayant des ADN différents. Enfin on a un large choix de

 fragments à analyser.

Matériels méthodes :

Le TP se déroule en deux jours (11 étapes au total).

Le premier jour :

Tout d'abord, il y a la digestion de l'ADN par des enzymes de restriction. Une enzyme de

 restriction est une enzyme capable de couper l'ADN au niveau de son site de restrictio.

 Lorsqu'on coupe une molécule circulaire à un endroit, on obtient un seul fragment alors

 que si l'on coupe a deux endroits différents, on obtient deux fragments. Les fragments

 obtenus sont ceux qui ont les extremités EcoR1 et Hind III. Dans un plasmide, il y a donc

 un site de coupure par une enzyme de restriction spécifique, favorisant l'insertion du

fragment d'ADN dans 2 sens. Un meme plasmide peut avoir deux sites de la même

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