TP Biologie Moléculaire

I- Identification d'Esherichia Coli par PCR

L'identification de micro-organismes peut se faire par des méthodes microbiologiques classiques (enrichissement, isolement, identification). Cependant cela va nécessiter un temps d'analyse trop important. Des techniques rapides, telle que la PCR, ont été mises au point afin d'accélérer la procédure d'identification. Nous allons donc utiliser cette dernière lors de notre TP

Matériaux:- Un appareil de PCR (thermocycleur)

- Un couple d'amorces spécifiques de cette bactérie (E1 et E2)

- Une TAQ polymérase

Notre groupe de TP devra déterminer l'impact de la concentration en ions magnésium dans le mélange réactionnel pour cette identification par PCR

Logigramme PCR seule :

Culture de Bactéries d'E.Coli

dans milieu LB liquide

24H à 37°C

Extraction rapide d'ADN chromosomique

30 minutes

Préparation du Prémix de PCR

Dénaturation

↓

X Cycles Hybridation PCR

↓

Élongation

Révélation sur Gel d'Agarose

(1H de préparation 3H de migration + 30 minutes de révélation)

A) Extraction rapide d'ADN chromosomique d'E.coli :

On va utiliser cette technique car elle est très rapide par rapport à d'autres, cependant nous n'auront pas une ADN ultra pure mais largement suffisante pour notre TP.

a) But

Le but est de récupérer de l'ADN chromosomique pur d'E.coli pour avoir une matrice à amplifier par la suite.

b) Matériaux

→ Centrifugeuse → Tubes eppendorfs → Eau physiologique → Eau stérile

→ Milieu de culture LB liquide d'E.coli → Bain marie

c) Explications des étapes

→ 1ère Centrifugation : Permet de récupérer le culot contenant les bactéries avec l'ADN chromosomique. On cherche donc à éliminer les impuretés et le milieu LB liquide.

→ Suspension dans de l'eau Physiologique : Permet d'éviter un choc osmotique entre les bactéries et le milieu extérieur. Nous allons donc avoir un équilibre de concentration entre le milieu à l'intérieur des bactéries et le milieu extérieur à ces dernières. Nous n'allons pas avoir de croissance de bactéries. De plus, le milieu LB liquide qui aurait pu être récupéré en faible quantité avec les bactéries va être de nouveau dilué.

→ 2ème centrifugation : Permet de récupérer de nouveau le culot contenant les bactéries et d'éliminer les restes de milieu LB liquide.

→ Suspension dans de l'eau stérile : Permet le choc osmotique. Les bactéries vont être lyser et donc l'ADN chromosomique va pouvoir sortir de ces bactéries.

→ Incubation à 95°C : Permet de lyser les bactéries qui auraient pu résister au choc osmotique. De plus, les protéines vont être dénaturer ce qui est une bonne opération pour nous puisqu'elles auraient été gênantes pour la récupération de l'ADN chromosomique pure.

→ 3ème centrifugation : Permet d'éliminer tous les débris cellulaires, qui nous sont d'aucunes utilités, en récupérant seulement le surnageant où l'on va trouver notre ADN chromosomique, des polyanions ainsi que l'ARN.

→ Mettre dans la glace : On met ce surnageant dans de la glace à - 20°C afin de conserver l'ADN chromosomique pour pouvoir commencer une autre manipultation.

B) Préparation du mix PCR :

a) But

Préparer les tubes de PCR contenant les réactifs spécifiques de chaque réaction de PCR. Le groupe A1 devra mettre au point le paramètre sur la concentration en ions magnésium dans le mélange réactionnel.

b) Matériaux

→ Réactifs PCR → Tubes eppendorfs → Vortex → Eau → ADN glacé → Bain marie

c) Explications des étapes

Pré mix :

→ Primer E1 et E2 : Permet d'amplifier un fragment de 585 paires de bases du gène malE d'E.Coli qui est spécifique.

→ TAQ Polymérase et 4 dNTP : Élongation et amplification de l'ADN sélectionné par les amorces.

Les dNTP sont les bases ATCG qui vont servir à polymériser le brin d'ADN suivant le brin matrice. La TAQ Pol est obligatoirement

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