Tp Clonage Moléculaire

Méthode de clonage par la technologie

de l’ADN recombinant :

Les enzymes de restriction, outils de la

biologie moléculaire

JACQUEMOT Loïc

Groupe 2

J1106149@etumel.fr

I- Résumé

Nous avons cherché à travers ce TP à cloner une molécule d’ADN à partir d’un plasmide

d’une bactérie. Pour ce faire, nos outils principaux ont été les enzymes de restriction qui nous

ont permis de sectionner les molécules d’ADN afin de les recombiner entre elles. La

technique d’électrophorèse nous aura permis de vérifier le bon fonctionnement de ces

enzymes et de connaitre la taille des fragments produits. L’utilisation des plasmides de

bactéries comme vecteur de clonage nous aura permis quant a lui de multiplier notre molécule

d’ADN en cultivant les colonies.

II- Abréviations

¢ : Cellules compétentes

ƛ : ADN du phage ƛ

pBS : plasmide pBlueScript

TpE : tampon de digestion 10X

TpL : tampon de ligation 10X

EcoRI : enzyme de restriction Eco RI

HindIII : enzyme de restriction Hind III

Lig : Ligase (enzyme)

Pb : paires de bases

III- Introduction

La génétique bactérienne est une science récente qui a permis de réaliser de nombreuses

découvertes sur les fonctions de l’organisme et qui continue, de nos jours, de faire progresser

nos connaissances en termes de génétique et de manipulation du génome.

L’objectif principal de ce TP est de comprendre et de manipuler des techniques de biologie

moléculaire. Concrètement, nous allons donc réaliser un clonage de molécules d’ADN du

phage ƛ (le phage ƛ est un virus bactériophage qui infecte la bactérie Escherichia coli). Cette

technique est utilisée afin de faire produire à la bactérie une protéine spécifique. La

production de ces protéines est habituellement réalisée afin de fournir de nombreux secteurs

notamment celui de la médecine. Actuellement, on étudie par exemple le moyen de créer un

médicament contre les troubles liés à la mucoviscidose.

IV- Résultats et Discussion

JOUR 1 :

Il convient avant de commencer de définir quelques notions essentielles.

Nous avons à notre disposition la molécule d’ADN du phage ƛ que nous souhaitons cloner

ainsi que le plasmide pBS. Un plasmide est une molécule d’ADN circulaire se trouvant dans

le cytoplasme de leur cellule hôte (généralement une bactérie). Une particularité de ces

plasmides est qu’ils sont capables de réplication autonome et c’est cette particularité que nous

allons exploiter afin de cloner notre ADN. Ceux-ci nous serviront donc de vecteur de clonage.

La première étape est la digestion de l’ADN ƛ et de notre plasmide par des enzymes appelée

enzyme de restriction. Elles ont pour rôle de couper l’ADN pBS et l’ADN ƛ en des sites

précis appelés sites de restriction. Chaque enzyme de restriction possède un site spécifique.

Etape 1 : Digestion de l’ADN du phage ƛ et du pBS

Nous utiliserons ici les enzymes EcoRI et HindIII. Dans un premier tube Eppendorf, nous

introduisons donc l’ADN ƛ et dans le deuxième le pBS. Les enzymes sont conservés dans des

bacs à glace afin qu’elles restent inactives. Nous les utilisons donc au donc au dernier

moment. Dans chaque tube, on rajoute dans l’ordre un tampon de digestion, de l’eau stérile,

l’enzyme EcoRI puis pBS. Le tampon utilisé ici est du glycérol. Les volumes sont prélevés à

l’aide d’une micropipette pour optimiser la précision. Nous utilisons à chaque prélèvement un

cône différent afin de ne pas contaminer les tubes.

A la fin de la manipulation, nous observons des gouttes sur la paroi des tubes. Nous utilisons

donc la centrifugeuse de paillasse. Les 2 solutions sont homogènes. Nous utilisons 5 unités

d’enzyme pendant 30 minutes de sorte à digérer entièrement le plasmide.

Après les 30 minutes d’attente, nous introduisons les 2 tubes au bain-marie à 70°C afin

d’inactiver les enzymes.

Nous avons donc obtenu dans nos 2 tubes les ADN pBS et ƛ digérés par les enzymes de

restriction et désormais séparés en fragments d’ADN. Nous savons que le plasmide ne

possède qu’un seul site de restriction pour chaque enzymes que nous avons introduite ce qui

nous permettra de savoir exactement la position du fragment d’ADN que nous allons

incorporer dans celui-ci ainsi que sa taille car nous connaissons les sites de restrisction de

EcoRI et HindIII. En coupant l’ADN circulaire en 1 seul endroit, nous obtenons un seul

fragment, en coupant à 2 endroits, nous obtenons 2 fragments…

Figure1

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