Compte-Rendu de Biologie moléculaire : le clonage

INTRODUCTION

Le clonage moléculaire est une technique de génie-génétique très utilisée dans les laboratoires de recherche. Elle peut être utilisée dans le cas de certaines maladies génétiques tel que le nanisme qui est due à un manque d' hormone appelée somatotrophine, qui est une protéine. Le clonage moléculaire aboutira à la formation de cette protéine en très grande quantité, de manière contrôlée. L'idée est donc d'isoler un fragment d'ADN, l'introduire dans un vecteur de clonage et le reproduire en très grand nombre.  

   Les biologistes ont du faire face à plusieurs problèmes, tels que : comment obtenir l'ADN de l'organisme donneur, de quelle manière peut-on couper l'ADN pour en obtenir des fragments, comment introduire ce fragment d'ADN dans un vecteur de clonage, comment introduire l'ADN recombinant dans une cellule hôte et comment peut-elle se multiplier. Les progrès scientifiques réalisés au cours du 20ème siècle ont permis de remédier et de répondre à ces problèmes biologiques.

   Le clonage moléculaire est aujourd'hui une technique très utilisée car elle est peu coûteuse, très efficace , et offre la possibilité de nombreuses applications. Elle peut être adoptée dans le cas du séquençage de génomes ou pour faire exprimer un gène.

RESULTATS ET DISCUSSION

 Fragments d'ADN produits pendant la digestion de l'ADN lambda et celui du plasmide pBS par les enzymes de restriction

Lors du premier jour de notre expérience nous avons effectuer une digestion de l'ADN du bactériophage lambda avec des enzymes Eco R1 et Hind III. Les enzymes de restriction sont des enzymes bactériennes qui reconnaissent des séquences spécifiques sur l'ADN . Elles coupent l'ADN au niveau des laisons phospodiesters, elles ont donc une activité endonucléase de restriction.  Ensuite, nous avons réalisé une seconde digestion du plasmide pBS avec les mêmes enzymes de restriction. Ces digestions ont aboutit à la formation de plusieurs fragments de tailles différentes. On peut prévoir le nombre et la taille des fragments produits après la digestion avec des enzymes en réalisant une carte de restriction .

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Figure 1.  Carte de restriction de l'ADN lambda. (A) Sites de restriction de l'enzyme EcoRI (B) Sites de restriction de l'enzyme HindIII

Dans la figure 1, nous pouvons voir que la digestion de l'ADN lambda par les enzymes de restriction mènera à la production de 13 fragments. Cependant, pas tous les fragments sont clonables tel que les extrémités de l'ADN : 1-E ; E-4800 car ils ne possèdent aucune enzyme à une de leurs extrémités. On peut donc supposer que 11 fragments d'ADN sont clonables.

Figure 2. Taille et représentation des fragments d'ADN[pic 4]

Cependant, dans la Figure 2, nous remarquons que les fragments 3,8 et 9 sont coupés par la même enzyme à la fois. On retrouve ce type de fragment de façon hasardeuse. Ces fragments risquent de se refermer car ce sont deux enzymes identiques donc les extrémités seront attirés. Ce risque diminue l'efficacité du clonage donc on favorisera l'utilisation des 8 autres fragments.

La visualisation des fragments est possible par une analyse par électrophorèse sur gel d'agarose des fragments d'ADN produits pendant les digestions réalisés. Nous avons effectuer cette technique lors de notre expérience.

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Figure 3. A)Électrophorèse 1 de l'ADN lambda et du plasmide pBS après digestion enzymatique. B)Électrophorèse attendu de l'ADN lambda après digestion enzymatique

La figure 3 représente la première électrophorèse réalisée. On peut remarquer à gauche 3 fragments d'ADN lambda représentés par des bandes. On peut supposer que ce sont les fragments de 21226 pb; 5148 pb et 4268 pb. A droite on remarque la présence du plasmide pBS à environ 2000 pb possédant qu'une seule bande,car l'autre fragment est trop court pour être visible, il a 12 pb. Cependant la bande présente n'est pas réellement visible sur la figure en raison d'une mauvaise qualité photo.

En théorie on devrait avoir 13 fragments dont 8 clonables cependant les fragments les plus visibles sont les plus gros car ils fluorescent plus. L’absence des 10 autres fragments peut être aussi due à une mauvaise digestion de l'ADN lambda par les enzymes de restriction. En effet, il y a eu une erreur de manipulation lors du dosage du tampon de digestion. Pour éviter ces erreurs, on pourrait utiliser des pipettes électroniques qui ont une précision beaucoup plus élevées que les pipettes utilisées lors de notre expérience. Les pipettes électroniques garantissent des résultats indépendants de l'utilisateur.    

Étalement des bactéries  transformées sur les boîtes de Pétri

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Figure 4. Étalement des bactéries transformées sur des boîtes de Pétri contenant du milieu de culture

Les boîtes de pétri de la figure 4 représentent celles obtenues lors du clonage.Théoriquement, on voudrait obtenir que des colonies blanches et bleues dans la boite L1 (lambda + plasmide), deux fois plus de colonies blanches et quelques colonies bleues dans la boite L2 (2*plus de lambda+plasmide) et seulement quelques colonies bleues dans la boîte L3 (plasmide). La boîte L1 est vide, il n'y a ni de colonies bleues, ni de colonies blanches. On peut supposer qu'il y a eu un problème lors de la ligation. En effet, une erreur du dosage de l'enzyme ligase a empêché aux fragments d'ADN de se lier au plasmide digéré, ceci a entraîné des plasmides vides. De plus, il y a eu un problème lors de la transformation bactérienne qui n'ont reçues aucun plasmide et sont mortes car elles n'ont pas reçus le gène de résistance à l'ampicilline. Cela a été causé par une mauvaise réalisation du choc thermique, il n'y a pas eu un respect total du maintien des bactéries dans la glace. Pour remédier à ce problème il faut respecter à la lettre les indications données et être très attentif. On pourrait aussi mettre les tubes dans un incubateur agitateur de précision à 37°C, au lieu de les mettre au bain marie pendant 30 minutes. Cela augmentera l'efficacité de la transformation bactérienne.

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