Biologie moléculaire
Dissertation : Biologie moléculaire. Recherche parmi 300 000+ dissertationsPar Morane Houdeville • 21 Avril 2017 • Dissertation • 1 753 Mots (8 Pages) • 1 287 Vues
TP Biomol
Introduction
Le bactériophage M13 est un phage à ADN monocaténaire circulaire qui présente des formes réplicatives double brins. Ce phage ne lyse pas la cellule contrairement à la plupart des phages. On l’a donc utilisé pour cloner un fragment d’ADN dans ce phage. Cependant, le phage est bicaténaire donc il ne peut plus infecter la cellule naturellement. On utilisera le chlorure de calcium pour faire entrer le vecteur dans la cellule. Le phage ressort sous forme monocaténaire avec notre fragment d’ADN à séquencer. On va ensuite infecter les bactéries. Lorsque le cycle d’infection sera fini, on récupère notre fragment. On peut mettre une amorce et faire un séquençage. Quand on utilise des plasmides, sur la boite on voit des clones. Quand on utilise des bactériophages, on voit des plages de retard de croissance. Dans ce cas, on récupère les colonies blanches, en effet, le décalage de phase de lecture importe peu car on fait du séquençage. Seule la production de protéine nécessite la position de l’insert en phase avec le gène de la béta gal. Dans le cas du phage pUC bicaténaire, on utilisera deux amorces pour faire le séquençage. |
Rappel: un vecteur possède une origine de réplication, un site multiple de clonage et un système qui permet la sélection.
Souche bactérienne utilisée: E. coli XL1 blue (recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)])
- retourner voir dans le manuel
Utilisation d’un phage M13 → simple brin (forme +) : il est nécessaire d’utiliser un phage sous forme double brin (plus de rendement pour la transformation), on utilise donc la forme réplicative du phage M13.
La forme réplicative du phage M13 (forme + et -) se retrouve chez les bactéries infectées
La réplication se fait selon le principe du brin roulant
Une bactérie infectée ne donne pas des clones mais des plages de retard de croissance.
Explication très simplifiée de la réplication en cercle tournant chez les virus:
Une coupure au niveau d'un brin. A partir de la coupure, on tire sur une extrémité qui devient alors simple brin. Ces extrémités simples brins servent de matrice pour la synthèse du brin complémentaire, en déroulant un brin autour de l'autre.
[pic 1]
La polymérase reste sur le brin - (après sa synthèse) et va faire des tours de manière continue: autant de brin + que de tours. Cela permettra de synthétiser de nombreuses molécules d’ADN qui pourront être utilisées pour refaire des phages. Le phage M13 n’est pas un phage lytique (contrairement au phage lambda): les protéines de sa capside, de son enveloppe (et autres) sont insérés à la membrane de la bactérie et le phage sera reconstruit lors de l’association de l’ADN avec les protéines présentes dans la membrane: pas de lyse cellulaire. La production des phages induit un retard de croissance.
(en plus: le phage M13 ressort de la cellule sous forme simple brin => très utile pour le séquençage qui pourra se faire directement).
But du clonage: mettre l’insert d’ADN d’intérêt dans un vecteur:
- ligation de l’ADN dans le vecteur au préalable ouvert par une enzyme de restriction
II. Ligation
- vecteur : digéré par PstI (CTGCA/G), action de la phosphatase alcaline: 7 250 pb (Mvecteur = 7 250 * 660 = 4.785 * 106 g/mol)
- nvecteur = mvecteur / Mvecteur = 20 * 10-9 / 4.785 * 106 = 4.1797 * 10-15mol)
- insert : digéré par PstI (trois sites de coupures, voir séquence), on ne garde que le plus gros morceau entre deux sites de restriction : 385 pb (Minsert = 254 100 g/mol)
- ninsert = 3 * nvecteur = 3 * 4.1797 * 10-15 = 1.2539 * 10-14 mol
- minsert = ninsert * Minsert = 1.2539 * 10-14 * 254 100 = 3.1862 * 10-9 g = 3.1862 ng
- tampon de ligation (10X) = 2µL
- 2,5 U de T4 DNA ligase
- eau qsp 20µL
Témoin:
Le témoin permet de vérifier qu’il n’y a pas d’autres ADN dans notre milieu qui peuvent se lier au vecteur, cela permet de vérifier qu’il n’y a pas de contamination.
Explications annexes
Il y a deux sens d’insertion de l’insert car les deux extrémités sont les mêmes. Dans les deux cas, la présence de l’insert dans le vecteur induit un décalage du cadre de lecture qui donne lieu à un codon stop prématuré. Ainsi dans le cas où l’insert et le vecteur ont été ligués entre eux, la présence de ce codon stop empêchera la synthèse de LacZ. Ainsi, la bactérie ne sera pas capable de synthétiser la galactosidase correctement, elle sera donc incapable d’hydrolyser le X-Gal et la colonie sera blanche.
Dans le cas où le vecteur ne possède pas l’insert, LacZ pourra être synthétisé et l’hydrolyse du X-Gal produira un composé rendant la colonie bleue.
Dans le cas du témoin, la phosphatase alcaline empêche le vecteur de se refermer sur lui même. Or, il est beaucoup plus facile de transformer des bactéries avec de l’ADN circulaire double brin, qu’avec de l’ADN non circulaire. Dans le cas où l’ADN serait transféré dans la bactérie, la machinerie cellulaire remettra l’ADN sous forme circulaire et LacZ fonctionnera (colonie bleue).
B. Enzymes de restriction
[pic 2]
Une enzyme de restriction permet de couper l’ADN double brin au niveau d’un site particulier (palindrome). C’est une endonucléase qui clive la liaison phosphodiester entre deux nucléotides à l’intérieur d’une chaîne d’acide nucléique.
Les enzymes de type II reconnaissent un site spécifique (contrairement au type I qui coupe de manière aléatoire toutes les 1000 pb et au type III qui reconnaît une séquence et qui coupe une 20aine de nt plus loin).
Ces enzymes peuvent couper au même endroit sur les deux brins (bouts francs) ou à différents endroits comme c’est le cas pour PstI (bouts cohésifs). Dans le cas des bouts cohésifs, il peut y avoir des extrémités 3’ sortantes (c’est la partie 3’ qui est sous forme simple brin) ou des extrémités 5’ sortantes.
...