La biologie moléculaire (document en portugais)

A biologia molecular proporciona a análise e estudo do complexo genoma de seres eucariontes e procariontes para fins terapêuticos, investigação ou diagnóstico. Para tal, é necessária a extração de ácidos nucleicos e o isolamento dos diferentes tipos de ácidos nucleicos, ou seja, separar DNA ou RNA dos restantes constituintes celulares.

No núcleo da célula encontramos o DNA (ácido desoxirribonucleico), uma sequência nucleotídica que contem o genoma de forma estável mas não rígida, permitindo a transmissão de informação às células filhas, expressando a informação genética. Esta molécula é constituída por duas longas cadeiras antiparalelas e complementares ligadas por pontes de hidrogénio, segundo o modelo de dupla hélice. O ADN encontra-se disposto em groves major ou minor consoante o grau de condensação da molécula, ou seja, encontra-se associado a histonas quando não está a ser replicado ou transcrito, ou de forma linear quando está ativo.

O mtDNA (DNA mitocondrial) é uma molécula dupla, circular, pequena e compactada existente na mitocondrial. Está duplicado na mitocôndria de 2 a 10 vezes. Contem um número limitado de genes que codificam moléculas importantes para a cadeia respiratória mitocondrial, alguns RNA ribossomais e de transferência. Esta molécula tem uma grande taxa de mutações, sendo uma boa forma de identificação de indivíduos e populações. É herdade por via exclusivamente materna.

O RNA (ácido ribonucleico) é uma molécula nucleotídica, composta por uma cadeia simples e menos estável que o DNA. Está presente no núcleo e, maioritariamente, no citoplasma celular. As suas funções são essencialmente transferir a informação do DNA para o citoplasma (RNA mensageiro), colaborar na tradução (RNA ribossómico) e transportar os aminoácidos (RNA transferência). O mRNA (RNA mensageiro) é uma molécula linear mas o tRNA (RNA transferência) e o rRNA (RNA ribossómico) sofrem um rearranjo devido à complementaridade de bases. É uma molécula mais pequena que o DNA e, por isso, a absorvância é diferente, podendo ser distinguida do DNA.

A unidade básica destes ácidos nucleicos é o nucleótido. Este é constituído por três elementos básicos: um grupo fosfato, um açúcar pentose e uma base nitrogenada. Existem duas pentoses diferentes: os nucleótidos do DNA têm uma desoxirribose e os do RNA têm uma ribose. São as bases nitrogenadas que conferem diversidade aos ácidos nucleicos e, por isso, são o fator que confere diversidade ao DNA. Existem 5 nucleótidos diferentes consoante a variabilidade da base nitrogenada, nomeadamente, a adenina, a guanina, timina (presente apenas no DNA), citosina e o uracilo (presente apenas no RNA). Devido às suas ligações duplas, a adenina liga-se à timina, no DNA, e ao uracilo, no RNA. Devido às suas ligações triplas, a guanina liga-se à citosina, quer no DNA quer no RNA. À sequência nucleotídica chama-se Código Genético que é variável nos indivíduos mesmo que da mesma espécie. Para que esta linguagem seja válida e útil, é necessário que seja transcrita e, posteriormente, traduzida para linguagem proteica, ou seja, na sequencia de DNA transcrita e traduzida, cada 3 bases azotadas vai corresponder a um aminoácido específico, consoante a sequência de bases apresentadas.

A extração de ácidos nucleicos é um passo sensível e essencial para posteriores estudo dessas moléculas.

O DNA pode ser extraído de culturas celulares sólidas (culturas de bactérias) ou líquidas (culturas de células animais, normalmente), sangue, líquido amniótico, tecidos parafinados e tecidos criopreservados, sendo que a urina não permite obter ácidos nucleicos de boa qualidade. Uma célula humana normal e diplóide contem cerca de 7pg de DNA genómico e mitocondrial, sendo que o DNA extraído é uma mistura de ambos em proporções variáveis. O facto do DNA mitocondrial estar misturado com o DNA genómico não interfere nos estudos do DNA.

Para se proceder ao isolamento de DNA é necessário seguir um protocolo específico e rígido para cada tipo de amostra, tendo etapas essenciais os seguintes passos:

1. Recolha:

• Deve ser realizada segundo normas específicas, por exemplo, no caso do sangue, deve-se proceder à colocação num meio anticoagulante imediatamente após a colheita, para evitar agregação celular.

• Em tecidos de tecidos parafinados há que ter em atenção que se deve proceder à desparafinação e hidratação celular para se dar inicio ao processo de extração.

2. Isolamento das células de interesse:

• No caso do sangue procede-se à lise de eritrócitos através do uso de um meio hemolítico, onde os eritrócitos tornam-se instáveis e rebentam. Em seguida, procede-se à centrifugação da amostra de forma a separar os restos celulares dos eritrócitos e as plaquetas dos leucócitos, uma vez que estas últimas se depositam no fundo do tudo por terem maior peso.

3. Rebentamento das membranas isoladoras da célula:

• Nas células vegetais desagrega-se a parede celular.

• Em todas as células desagrega-se a membrana celular com a ajuda de um tampão de lise, diferente consoante o tipo celular.

4. Destruição das enzimas degradadoras de DNA

5. Removem-se os organelos celulares

6. Lise da membrana nuclear e precipitação do DNA em soluções alcoólicas, através do uso de um sal que se liga aos grupos fosfato,

Quando maior o tamanho dos fragmentos de DNA obtidos melhor é sua qualidade. Para tal, o processo deve ser o menos violento possível e as endonucleases – enzimas com capacidade de talhar o DNA – devem ser neutralizadas eficazmente.

A extração de RNA é relativamente mais simples que a de DNA, não sendo um processo muito diferente. Uma célula de um mamífero tem cerca de 20pg de RNA, 80% do qual é rRNA. A sua análise é muito importante, por exemplo, no estudo da expressão e regulação génica nos diferentes tipos celulares e, ao contrário

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