Fractionnement cellulaire et mise en évidence de réactions d’oxydo-réduction du métabolisme respiratoire.

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Résumé :

Notre TP de biologie cellulaire portait sur l’isolement et la caractérisation des mitochondries. Nous avons mis en évidence des réactions d’oxydo-réduction du métabolisme respiratoire. Nous avons isolé les mitochondries par fractionnement cellulaire et étudié l’activité « succinate-cytochrome c réductase » de la chaine respiratoire.

Nous avons analysé le passage du cytochrome c de la forme oxydée à la forme réduite par spectrophotométrie à 550 nm.

Introduction :

Les mitochondries sont des organites présents dans la plupart des cellules eucaryotes. Leur taille varie généralement entre 0,5 et 1 μm de diamètre. Elles sont souvent décrites comme les « centrales énergétiques » des cellules, car elles contribuent à l'essentiel de la production d'ATP.

L'ATP est la molécule énergétique utilisée dans un très grand nombre de réactions chimiques du métabolisme.

Les mitochondries interviennent également dans la signalisation cellulaire, la différenciation cellulaire et la mort cellulaire, ainsi que dans le contrôle du cycle cellulaire et de la croissance de la cellule.

Cet organite est composé de plusieurs parties:

La membrane externe, l'espace inter-membranaire, la membrane interne, et la matrice mitochondriale.

Les protéines mitochondriales dépendent des espèces et des tissus considérés. Chez l'homme, les mitochondries cardiaques contiennent au moins 615 types de protéines différents.

Enfin, les mitochondries possèdent leur propre génome, dit génome mitochondrial, dont l'ADN présente de nombreuses analogies avec le génome des bactéries.

Les mitochondries jouent un rôle majeur dans la production d’énergie (voir fiche annexe).

La fermentation génère de l'énergie et correspond au catabolisme du glucose, dans le cytoplasme, en milieu anaérobique et ne fait pas intervenir la mitochondrie.  

Elle permet la dégradation partielle du glucose en acide lactique et ne permet la synthèse que de 2 ATP par molécule de glucose. La respiration  produit 36ATP, d'où son importance pour les cellules eucaryotes, grandes consommatrices d'énergie.

Nous allons mettre en évidence les réactions d'oxydo-réduction du métabolisme respiratoire, sur des fractions mitochondriales.

Pour cela, nous allons devoir  libérer les mitochondries contenues dans les cellules de pomme de terre et éclater leur membrane pour exposer leur membrane interne.  

Nous allons aussi bloquer la chaîne respiratoire au niveau du complexe IV.

Matériels et méthodes :

Broyage

        Tout d’abord nous avons épluché les pommes de terre pour nous débarrasser de la peau riche en chloroplastes. Ces derniers étant de même poids moléculaire que les mitochondries et absorbant des longueurs d’ondes différentes de nos cellules étudiés, cela fausserait nos résultats. Nous lavons ensuite les patates, puis les découpons en petits morceaux pour faciliter leur broyage.

Nous y ajoutons ensuite du Tris-HCl servant de tampon pour prévenir des variations du pH, du Saccharose pour permettre aux molécules d’eau d’entré dans les cellules par osmose, et ainsi faire éclater les cellules pour libérer les mitochondries, de l’EDTA pour inhiber les protéases libérées, de la BSA qui va elle aussi inhiber l’activité protéasique en se fixant sur les protéases, et de cystéine qui va détourner l’activité protéasique puisqu’il va être détruit par les protéases.

Nous avons ensuite mis le tout dans un broyeur à hélice pendant 1min, puis filtrer dans un erlen à l’aide d’une double gaze posé dans un entonnoir.

Nous avons dut ensuite vérifier le pH, et le rajuster à 7,5 à l’ide d’une solution de Tris 2M (1 ou 2 goutes suffisent.

Centrifugation différentielle

        Ensuite nous avons passé à la centrifugation différentielle pour sédimenter les éléments les plus lourds comme le noyau, les amyloplastes ou les débris, qui vont se retrouver au fond, dans le culot.

1° centrifugation : dans un rotor GSA à 4500 rpm pendant 15 minutes.

Le surnageant 1 est transféré délicatement sans décoller le culot, sinon les éléments lourds se retrouveraient à nouveau mélangés avec les chloroplastes, dans un nouveau pot de centrifugation

2° centrifugation : Le surnageant 1, qui contient les chloroplastes et autres élément, est placé dans le rotor GSA à 4500 rpm 15 min.

On récupère le surnageant 2 de la même manière.

Cette deuxième centrifugation permet d’être plus sure que l’on se soit débarrasser des éléments lourds.

3° centrifugation : Le surnageant 2 est placé dans un rotor GSA à 1000 rpm pendant 20min.

Cette fois ci nous jetons le surnageant qui contient les éléments plus léger que les mitochondries.

On récupère donc le culot composé d’un extrait de fragment brut de mitochondries (ainsi que d’autres éléments de même masse moléculaire) avec une coloration marron-rouge dut à la présence des atomes de fer des cytochromes.

Lavage

Ensuite nous avons réalisé un lavage.

Nous ajoutons une solution de lavage (2Ml (solution de broyage sans cystéine) et nous remettons le culot en suspension à l’aide d’un pipetman, puis nous le transférons dans un tube de centrifugation froid, pour le centrifuger à 1000 tpm pendant 20min dans un swinging rotor HB-6.

En centrifugeant on obtient un culot de mitochondries sans membranes externes. On va utiliser le potter pour faire éclater les mitochondries et démasquer ainsi la membrane interne pour exposer la chaine respiratoire au milieu.

Afin d’inhiber les protéases et que la réaction ne se produise pas dans la fraction mitochondriale, on conserve cette dernière dans la glace avant la mesure spectrophotomètre.

Mise en évidence in vitro de l’activité succinate-cytochrome C réductase

        Pour mettre en évidence l’activité succinate-cytochrome C réductase, on réalise une analyse par spectrophotométrie de l’absorbance des mitochondries.

On a préparé 3 cuves :

-La cuve 1 ; contenant du cytochrome C oxydé, du tampon phosphate et la fraction mitochondriale. Cette cuve sert de « blanc ».

-La cuve 2 ; contenant du cyanure et du succinate en plus des autres éléments présents dans la cuve 1.

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