Electrophorèse par gel d'acrylamide ou d'agarose

Électrophorèse par gel d’acrylamide ou d’agarose

But de la technique :

L’électrophorèse est une technique de séparation à l’aide de gels d’acrylamide  ou d’agarose, des molécules biologiques telles que : des acides nucléiques ou encore des protéines.

Principe de la technique : [pic 1]

Un gel d’acrylamide (CH2=CH-CO-NH2) à la capacité de séparer l’ADN seulement si celui-ci est extrêmement  petit, car l’ADN est une très grosse molécule. Le  gel d’acrylamide sépare donc facilement une protéine qui est une molécule beaucoup plus petite à l’inverse de l’ADN. Ainsi, pour séparer les acides nucléiques on utilise le gel d’agarose (C2H18O9) qui est tout à fait adéquat pour séparer les grosses molécules mais pas les petites molécules.

En ayant une approche de la taille  et connaissant les charges d’un mélange moléculaire, il est alors possible de déterminer son poids moléculaire.^[a] en s Le principe de la technique est donc de susciter une migration des molécules chargées plus ou moins négativement ^[b]en fonction de différentes variables telles que  la charge, la  masse, les  conditions physico-chimiques mais aussi du gel utilisé. La vitesse de séparation va ainsi variée.

Soumis à un champ électrostatique, les molécules chargées négativement, migrent vers le pôle positif en respectant les lois de l’électrostatique :  

        F=q*E         avec E la force du champ électrostatique, q la charge de la molécule et F la force générée mesurée en Newton

Néanmoins les molécules chargées soumettent une certaine résistance au système en fonction de :

• La taille et la forme de la molécule
• La taille des pores du gel d’agarose (polysaccharide) ^[c]ou acrylamide utilisé pour la séparation
• La teneur ou la viscosité du tampon

Le tampon a pour fonction de maintenir le pH à un certain niveau, il va également nuire à la mobilité des molécules suite à la résistance ionique qu’il soumet au gel. Les différents tampons tels que TBE (généralement utilisé sur gel d’agarose), TAE ou TPE diffèrent par leur taux de travail sur le gel et aussi par leurs compositions.

La concentration du gel à utiliser dépend de la taille de la molécule à étudier. Plus une molécule est petite de taille, plus on utilisera un gel d’une forte concentration. Le gel va  alors « séparer » de manière homogène grâce à un peigne afin ^[d]de facilité la migration des échantillons. En connaissant le temps de migration des échantillons, le gel sera plongé dans un un bain de solution^[e]. La migration sera plus ou moins longue en fonction du de gel^[f] utilisé car celui-ci va créer des réseaux et empêcher le déplacement de la molécule.

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