Cr Préparation et analyse de la Caséine

Préparation et analyse de la Caséine

Résumé

Ce TP à pour but d'étudier la Caséine. Pour cela, il a fallu extraire la molécule du lait, déterminer sa concentration dans 20 mL de lait pour ensuite la purifée des autres acides aminés et l'analyser.

Introduction

Celon certaines études, la caséine pourrait être responsable de certains cancer. Or la caséine est présente dans le lait et nous en consommons  en moyenne 66 L par an et par habitant, sans compter tous les produits laitiers. Il est donc inportant de vérifier si la caséine est un facteur de cancer ou non. Pour cela nous avons réaliser cette expérience afin de pouvoir extraire et purifié la caséine pour notre prochaine étude.

Résultats

1. Précipitation au point isoélectrique

Le lendemain nous avons récupéré la caséine purifiée d'une masse de 0,54g et pour l'autre 0,40g. Nous obtenons donc respectivement un rendement de 71% et 96 %.

2. Dosage de la caséine

Grâce à la courbe étalon nous avons déterminer la concentration massique de tyrosine dans la solution mère d'hydrolysat de caséine qui est de 69,75.10-3 g/L.

De cette valeur on peut calculer la concentration molaire de la tyrosine = 69,75.10-3 x 2,00 = 1,3.10-1 mg/L. Mais cette valeur est uniquement pour 40 % d'acides aminés libres, donc pour 100 %, on trouve (1,3.10-1 x 100 )/40 = 0,325 mg/L.

A partir de cette concentration massique en Tyrosine nous avons pu calculer la concentration molaire de Tyrosine, sachant que la masse molaire de la Tyrosine est 181 g/mol. On obtient donc 0,325/181 = 1,7.10-3 mol/L.

Sachant qu'une molécule de caséine contient 3 molécules de Tyrosine, nous en avons déduit la concentration molaire des caséines = 1,09.10-3/3 = 3,63.10-4  mol/L.

La concentration massique en caséine est donc

Figure 1. Chromatographie sur couche mince des acides aminés et mélanges MD1 et MD2

égale à 3,63.10-4x25000 = 9,075 g/L.

3. Chromatographie sur couche mince

Grâce au rapport Rf, on a pu déterminer les acides aminés présent dans les tripeptides MD1 et MD2.

Pour MD1 :

Rf1 = 0,2/5,6 = 0,04

Rf2 = 2,5/5,6 = 0,45

Rf 3 = 3,3/5,6 = 0,60

Donc ce mélange est composé de Mis, Phe et Leu.

Pour MD2 :

Rf1= 0,35/5,6 = 0,07

Rf2 = 1,1/5,6 = 0,20

Rf3 = 1,4/5,6 = 0,25

Donc ce mélange est composé de Gln, Ala et Pro.

Matériels et Méthodes

1. Précipitation au point isoélectrique

     A un pH de 4.6, le molécule de caséine sont électriquement neutres. Il y a donc absence de répulsion ce qui facilite l’agrégation de ces molécules. On appelle ce pH le pHi ou point isoélectrique. On va utiliser cette méthode pour séparer la caséine des autres protéines du lait. Pour cela on abaisse le pH du lait jusqu'au pHi de la caséine en y rajoutant 5mL d'acide acétique à 0,2 mol/L dans un tube Falcon. La caséine va donc précipiter. De ce fait, on va centrifuger le tout pendant 10 min à 10°C à 4000tr/min, puis on élimine  le surnageant et on laisse égoutter le tube.

     On ajoute ensuite 10mL d'alcool à 70%, de ce fait le précipité a été remis en suspension une fois que l'on a agité le tube. On a donc centrifuger pendant 4 min à 4000tr/min. Et à nouveau, on a éliminer le surnageant et égoutter le tube.

     Une fois que cela a été effectuer, nous avons rajouter 10mL d'alcool à 95% puis effectuer une autre centrifugation de 5min à 4000tr/min. Le surnageant a été jeté une nouvelle fois et le tube égoutté.

     On obtient a nouveau un précipité que l'on va ensuite récupérer et faire sécher jusqu'au lendemain.

• Dosage de la caséine

     On réalise un dosage de la quantité de Tyrosine libre car une molécule de caséine contient trois Tyrosine afin de connaître la concentration en caséine de la solution.

     Pour effectuer ce dosage, il nous faut une solution de Tyrosine purifiée et hydrolysée qui a été préparée par les techniciens du TP car cette hydrolyse nécessite de travailler à forte concentration d'HCl et de température et ainsi de pression élevée. Ils obtiennent donc une solution pure de Tyrosine à 50mg/L solubilisé dans 0,2mol/L d'HCl.

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