Compte rendu Annexe TP oxygraphie L3 Biochimie

Compte rendu du TP oxygraphie

Lors de ce TP on se propose d’étudier la chaîne respiratoire mitochondriale de foie de rat. La chaîne respiratoire est un transporteur d'électrons situé au niveau de la membrane interne mitochondriale et joue un rôle essentiel au sein de la cellule , elle permet la respiration cellulaire ainsi que la production d'énergie sous forme d’ATP.

Ainsi la mesure de la consommation d’oxygène moléculaire à l’aide de oxygraphie permet de déduire le passage des électrons et protons à travers la CRM et la synthèse d’ATP. Dans une seconde partie nous approfondirons notre étude en mettant notre échantillon en présence de différents substrats et inhibiteurs afin d’observer le comportement cellulaire.

Le principe de l’ oxygraphie repose sur la mesure cinétique de l’oxygène. Sachant que l’oxygène est l’accepteur final de la respiration cellulaire, l'étude de la concentration en oxygène au cours du temps est révélatrice de l’activité mitochondriale. L’oxygène dissous dans le milieu réactionnel de la chambre de mesure, thermostatée à 30°C par le bain marie, diffuse à travers la membrane qui sépare l’électrode de la chambre de mesure. Une tension de polarisation est appliquée entre les deux électrodes. La différence de potentiel avec l’anode provoque le courant qui s'établit entre les deux électrodes. Il est alors proportionnel à la concentration en dioxygène dans l'électrolyte. Le courant produit est ensuite amplifié et convertis en une tension proportionnelle à la concentration en O2.

Résultats et interprétations.

Afin de mieux interpréter les résultats expérimentaux je propose une explication concise des rôles des différents paramètres expérimentaux et tampons utilisés. Tout d’abord le milieu de réaction est tempéré à 30°C soit la température physiologique du rat.

Le tampon de respiration est constitué d’ions salins qui permettent le contrôle de l’osmolarité et de favoriser la diffusion des solutés. De plus, il contient également 10 mM de KH2P4 qui va permettre l’apport du phosphate dans la réaction de transformation du ADP + Pi en ATP.

L'ensemble des tracés sont effectués dans les mêmes conditions avec un tampon de respiration, des mitochondries ( 10 µL (tracé 1 et 3) et 15µL (tracé 2 et 4). La consommation de l’oxygène est graphiquement représentée par une baisse de la courbe.

Tracé 1:

Pour le tracé 1 nous insérons le tampon de respiration dans un premier temps puis 10µL de suspension de mitochondrie nous observons une pente sur le graphique durant 2 minutes qui reflète une diminution de la concentration en O2 et donc qu’il y a bien respiration cellulaire.

Par la suite on introduit le succinate: la pente est plus forte donc plus l’oxygène est consommé. Et pour cause , le succinate a pour rôle cellulaire d’activer les complexes II , III et IV. Suivant la réaction suivante: Succinate + ½ O2 > Fumarate + H2O et libère 2 e-

L’ajout de la première dose d’ADP provoque une augmentation de la consommation d’oxygène. Car en effet une augmentation de la concentration en ADP dans le milieu active l’ATP synthétase et provoque la consommation d’O2. On observe par la suite que la pente s’annule quasiment ce qui montre que l’ADP a totalement été transformé en ATP le second ajout d' ADP montre les même résultats et avec une pente quasi similaire ce qui nous permet d’affirmer que les mitochondries du foie de rat fonctionnent tout à fait naturellement.

Le RCR est le rapport de contrôle respiratoire qui permet d’établir le lien entre la vitesse de respiration et la quantité d'ADP disponible dans le milieu.

Soit RCR1= Pente EIII / Pente EIV

On sait d’après le tracé 4 que 100% d’oxygène = 19.2 cm donc 1 cm correspond à 690 /19.2= 35.9375 nmole

Avec pour la pente E III = [consommation d’O2]/ temps= 27.112/ 3 = 9.03 en nmole d’oxygène par minute.

P2 = 3.59 nmol/min

D’où nous déduisons un premier RCR 1 = Pente EIII / Pente E IV = 2.5 sans unité car c’est un rapport de deux unités identiques.

Détermination du rapport ADP /O

Il s’agit d’un rapport qui établit le lien entre les atomes d’ATP nouvellement synthétisés et les oxygènes réduits.

Afin de déterminer la quantité d’ATP nous prenons comme référence les quantités initiales d’ADP introduites qui serviront à la synthèse de l’ATP.

Soit nADP = C ADP * V ADP

sachant que V ADP = 8µ L soit 8 . 10^(-6) L ; C ADP= 20mM = 20.10^(-3) M

Donc n ADP = C * V = 8. 10^(-6) x 20.10^(-3) = 1.6 .10^(-7) mol .

Quantité d’oxygène initiale

Elle correspond au volume initial de la chambre de mesure ayant un volume équivalent à celui du tampon de respiration soit V= 1.5 mL multiplié par la quantité de moles d’O2 dissous dans 1 mL à 30°C soit 460.10^-9.

Donc nO2 i = (460 .10^-9 * 1.5)/1 = 6.9 .10^-7 mol soit 690 nmol d’O2 avant l’ajout d’ADP.

Afin de déterminer la quantité d’oxygène final on se sert du tracé 4 car il arrive à l'épuisement de la totalité de l’oxygène

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