Compte Rendu de TP sur les glycosidases

CR GLYCOSIDASES

But : Le but de ce TP est de déterminer la structure d’un diholoside inconnu. Pour cela, nous avons analysé grâce à une CCM les produits d’hydrolyse du diholoside par différentes glycosidases, dont les spécificités d’actions nous apporte des information sur la nature des oses, ainsi que la présence d’un éventuel pouvoir réducteur par un test à la liqueur de Fehling.

Principes : Afin de parvenir à notre but, nous avons utilisé plusieurs principes et méthodes

- La CCM :

C’est une chromatographie d’adsorption basée sur les différences d’interactions des substances étudiées à l’égard de deux phases :

– La phase stationnaire fixée sur une plaque (ici du gel de silice)

– La phase mobile (ou éluant) composée ici d’un mélange acétone-eau (9 :1).

La séparation va se faire en fonction de la polarité des molécules. Les molécules sont plus ou moins retenues par l’adsorbant polaire qu’est la silice et plus ou moins entrainées par le solvant qui est moins polaire que la phase stationnaire. Les molécules les plus polaires sont les plus retenues elles migrent donc moins loin que les molécules les plus apolaires qui sont très facilement entrainées. La différence de migration entre les molécules d’un mélange permet de les séparer.

Chaque molécule migre de bas en haut d’une certaine hauteur, caractéristique de la molécule, que l’on appelle rapport frontal (ou rétention frontal).

Rf = d/D[pic 1]

L’identification des molécules se fait par comparaison des Rf trouvés avec ceux de molécules témoins car une même substance migre à la même hauteur dans des conditions opératoires identiques.

- L’hydrolyse enzymatique d’un diholoside :

La liaison osidique est une liaison éther-oxyde qui résulte de la condensation d’un groupement hydroxyle (fonction alcool du carbone anomérique d’un ose) et d’une fonction acide comme un alcool glucidique. Dans le cas de notre TP, cette liaison osidique peut se faire entre les deux -OH anomériques des deux oses ou bien entre le –OH anomérique d’un ose et l’alcool glucidique porté par le carbone n°4 de l’autre ose.

L’hydrolyse correspond au clivage de la liaison osidique par des enzymes appelées glycosydases. Les glycosydases sont spécifiques de la nature de l’ose qui engage son -OH anomérique, de sa série (D ou L), de son anomérie (α ou β) et aussi de sa forme cyclique (pyrane ou furane). Comme toutes les enzymes, elles ont des conditions optimales de fonctionnement qui peuvent être différentes (température, pH…).

- Test à la liqueur de Fehling

Il permet de mettre en évidence la présence d’un éventuel pouvoir réducteur.

FORMULE

Si la fonction carbonyle d’un ose est libre (donc si le –OH anomérique de l’ose n’est pas impliqué dans une liaison), elle va être oxydée par la liqueur de Fehling donnant ainsi du Cu2O qui est un composé rouge qui va précipiter : le sucre est alors dit réducteur. On peut également appliquer cette méthode sur des oligosides ou polyosides.

Résultats :

Après hydrolyse de notre diholoside inconnu par différentes glycosydases, nous avons analysé les produits obtenus par CCM que voici :

Le centre des taches est marqué par un point sur notre CCM et elles sont numérotées de haut en bas. Nous n’avons pas pût laisser le solvant monter assez haut pour séparer les molécules de façon très distincte (d’où les écarts de Rf dans notre tableau pour une même molécule), cependant cela suffit pour voir les tubes dans lesquels une hydrolyse a eu lieu et donc d’en déduire la composition de notre diholoside : une hydrolyse a eu lieu dès que l’on a plusieurs taches et, si ces taches ne sont pas assez bien séparées, qui n’est pas au même niveau que la tache du tube témoin négatif.

Les résultats sont consignés dans le tableau suivant.

Avec Rf = d/D

Exemple pour le dépôt 1

Les dépôts 1,2,3 et 9 nous servent de témoin pour le glucose, galactose et fructose. Au niveau du dépôt 9, nous distinguons bien trois taches car les trois sucres sont présents.

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